miR-19a下调THBS1促进结直肠癌转移的作用及机制研究

发布时间：2018-02-01 13:33

本文关键词： 结直肠癌 MiR-19a THBS1 VEGF 转移机制　出处：《第三军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：和绝大多数恶性实体肿瘤一样,血道转移和淋巴管转移是结直肠癌主要的转移途径。在适合手术治疗的结直肠癌患者中,有50%左右已经发生了微血管或微淋巴管的转移,这部分病人多数都会很快复发,5年生存率只有10%左右。因此,癌细胞的转移扩散是结直肠癌致死的主要原因。本课题检测了miR-19a在结直肠癌组织和结肠癌细胞株中的表达情况,并在结肠癌细胞株中验证miR-19a下调THBS1的基因表达对VEGF蛋白水平的影响及其对细胞增殖迁移能力的促进作用,进一步研究结直肠癌细胞的转移规律,揭示其内在机制。方法：本课题共分为四个部分。第一部分检测结直肠癌组织及结肠癌细胞株中miR-19a的表达情况,包括以下实验：①miR-19a在结直肠癌组织中的表达情况。收集临床结、直肠癌标本,并根据是否伴有转移情况分为两组,即有转移组和无转移组,用qRT-PCR的方法分别检测癌组织中miR-19a的表达情况。②miR-19a在结肠癌细胞株中的表达情况。选取不同恶性程度的结肠癌细胞株LoVo,SW480和HT29,仍然用qRT-PCR方法分别检测其miR-19a的表达情况。第二部分检测结肠癌细胞株中THBS1和VEGF的表达情况。包括以下实验：①qRT-PCR和Western-blot的方法分别检测结肠癌细胞株中THBS1基因表达和蛋白表达的情况。②Western-blot检测结肠癌细胞株中VEGF的表达情况。③免疫共沉淀的方法验证结肠癌细胞株中THBS1蛋白与VEGF蛋白结合作用。第三部分验证miR-19a对LoVo细胞THBS1表达的调控及其对LoVo细胞增殖和迁移能力的影响。①构建miR-19a的SiRNA质粒,并转染LoVo细胞。②验证miR-19a表达抑制前后LoVo细胞增殖转移能力的变化。第四部分通过双荧光素酶实验和双荧光素酶突变实验验证miR-19a能够与THBS1的3’端结合并抑制其表达。结果：①结直肠癌组织中miR-19a呈高表达,且有转移组的表达明显高于无转移组；结肠癌细胞株中miR-19a表达程度由高到低依次是LoVo、SW480和HT29。②qRT-PCR实验和Western-blot结果均显示结肠癌细胞株中THBS1的表达以HT29最高,SW480次之,LoVo最低,差异显著；Western-blot实验检测结肠癌细胞株中VEGF的蛋白表达情况结果以LoVo最高,HCT119和SW480次之,HT29最低,差异显著；③结肠癌细胞株LOVO、SW480和HT29中THBS1与VEGF的免疫共沉淀均呈阳性反应。④成功构建miR-19a的SiRNA质粒,并转染LoVo细胞。划痕试验和Transwell实验结果显示转染SiRNA质粒后LoVo细胞增殖和迁移能力均显著下降,THBS1的表达明显升高；⑤双荧光素酶实验和双荧光素酶突变实验结果显示miR-19a能够与THBS1的3’端结合并抑制其表达,当miR-19a表达被抑制时,THBS1表达明显升高。结论：①无论是结直肠癌组织中,还是结肠癌细胞株中,miR-19a均呈高表达,说明miR-19a与结直肠癌的发生发展关系密切。②结肠癌细胞株中,miR-19a的表达程度LoVo最高,SW480次之,HT29最低,这与细胞株的恶性程度一致,说明它与结直肠癌细胞的恶性程度密切相关。③结肠癌细胞株中,THBS1的表达程度与细胞株的恶性程度相反,与miR-19a的表达程度亦相反；VEGF的蛋白表达程度与结肠癌细胞株的恶性程度一致,与miR-19a的表达程度也一致；在结肠癌细胞株中,THBS1蛋白和VEGF蛋白的免疫共沉淀反应均为阳性。这说明THBS1和VEGF能在结肠癌细胞株中发生结合反应,并且都与结直肠癌细胞的恶性程度密切相关。④报告基因实验结果显示miR-19a通过与THBS1的3’端结合发挥表达抑制作用。⑤结肠癌细胞中,miR-19a通过下调THBS1基因表达使其蛋白生成减少,其与VEGF结合能力减弱,VEGF的蛋白水平升高,因而促微血管和淋巴管生成的作用增强,最终为结肠癌细胞通过新生微血管和淋巴管转移创造了便利条件。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.35

【参考文献】