miR-454抑制胶质瘤细胞增殖的机制研究

发布时间：2018-02-03 18:41

本文关键词： 胶质瘤 miR-454 PDK1 细胞增殖　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景：胶质瘤为目前世界范围内颅内最常见的恶性肿瘤,具有浸润性生长、手术后易复发等特点。胶质瘤通常起源于神经间质细胞或者神经实质细胞,按多种方法均可将胶质瘤进行分类,临床上的胶质瘤以星形细胞瘤最为常见。世界卫生组织按照恶性化程度将临床上胶质瘤划分为Ⅰ-Ⅳ级,其中Ⅰ级胶质瘤属于良性肿瘤,手术治疗能够将其清除,同时其较少出现恶性进展,患者预后效果较好；而Ⅱ、Ⅲ级胶质瘤恶性化程度较高,其特点是具有一定的侵袭性；Ⅳ级的恶性化程度最高,相较于Ⅱ、Ⅲ级胶质瘤更具有侵袭性,患者的预后情况也并不理想。通常将原发于脑实质内的定义为原发性胶质母细胞瘤,而继发性胶质母细胞瘤是由低级别的胶质瘤,如Ⅱ、Ⅲ级胶质瘤进一步恶变所形成的。尽管现在已有运用手术切除与放化疗相结合的综合治疗手段对胶质瘤患者进行治疗,然而患者的术后生存期仍然仅为1年左右。部分学者认为,胶质瘤之所以术后经常“死灰复燃”,有一个重要原因就是胶质瘤干细胞能够“抗拒”放化疗的杀伤。随着组织病理学和分子生物学的不断发展,近年来越来越多的学者将焦点集中于对于胶质瘤的基础研究,同时还对胶质瘤的临床病理异质性、基因的异常表达以及信号转导通路紊乱等一系列分子机制进行了深入探索,上述研究有助于我们更全面透彻的了解胶质瘤的发生和进展机制,这在临床上对胶质瘤患者的诊断和治疗具有十分重要的意义。同时,寻找新的治疗胶质瘤以及胶质瘤干细胞的药物或者分子靶向治疗手段是学界研究的热点、难点。大量研究证实,胶质瘤的发生和发展过程中,多种微小RNA (microRNAs, miRNAs)能够对其产生或正或负的调节作用,miRNAs这种独特的作用机制引起了学界的广泛关注。MiRNAs是长度在20-25个核苷酸(nucleotide, nt)范围内的一类内源性单链非编码小RNA, miRNA降解靶mRNA或者抑制其翻译的机制,是因为miRNAs与靶mRNA的3’非编码区能完全或者不完全互补,从而对机体生长发育、细胞分化、增殖以及凋亡等生理过程进行调控。因此,miRNAs就会和它的靶基因相作用形成一个重要的调控网络,这个调控网络不仅对细胞产生重要的影响,而且还对机体的生命活动产生多种影响。最近的研究发现,有超过50%的miRNAs定位于基因组的脆弱位点或者肿瘤相关基因区域,表明miRNAs可能与肿瘤的发生和发展过程密切相关。越来越多的研究证实miRNAs可对恶性肿瘤的生成和进展造成影响,这些影响主要表现为以下三个方面：首先,部分miRNAs在肿瘤的发生和发展中具有促癌基因的作用；其次,部分miRNAs可能抑制肿瘤的发生和发展,具有抑癌基因的功能；再次,某些致瘤病毒所编码的miRNAs能够参与相关恶性肿瘤的发生和发展,而病毒在其宿主体内存活,亦可对机体细胞中的miRNA勺表达进行调控,从而参与肿瘤的发生和发展。目的：研究miR-454通过抑制PDKl表达从而抑制胶质瘤细胞增殖的相关作用机制,以期为临床治疗胶质瘤提供新的有效靶点。方法：(1)荧光定量PCR检测50例胶质瘤患者瘤组织和人多形性胶质母细胞瘤(GBM)U87、T98G、A-172、LN18以及LN-229细胞系中miR-454和PDK1 mRNA表达；用western blot检测胶质瘤组织中PDK1蛋白的表达；分析胶质瘤组织中PDK1蛋白的表达与临床病理分级的关系。(2)向胶质瘤T98G和LN18细胞中分别转染miR-454 mimic(使用化学方法合成,模拟生物体内源的miRNA)和miR-454 inhibitor(使用化学方法合成的针对miRNA的抑制剂),MTT法检测细胞的增殖活性；平板克隆形成实验检测细胞增殖的影响；流式细胞术检测对细胞周期的影响。(3)用生物信息学方法预测miR-454的靶基因,检测共转染miR-454 mimic和PDK1-3'UTR/PDK1-3'UTR-mut(突变型)的T98G和I.N18细胞中荧光素酶的含量；western blot法检测转染miR-454 mimic 和 miR-454 inhibitor后细胞中PDK1、Cyclin D1、p21、p-pRb、pRb蛋白的表达。结果：(1)胶质瘤组织和细胞系中miR-454 mRNA的表达显著低于相应正常脑组织和细胞系；胶质瘤组织和细胞系中PDK1 mRNA及其编码蛋白的含量显著高于相应正常脑组织及细胞系；LSD法分析表明,Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤组织中PDK1蛋白的表达显著高于I级和II级；Spearman分析表明胶质瘤患者瘤组织中PDK1蛋白表达与临床病理分级呈正相关,即在高级别病例组中高表达,在低级别病例组中低表达。(2)成功构建miR-454过表达和miR-454表达抑制细胞模型；上调细胞中miR-454的含量能够抑制人胶质瘤LN18和T98G细胞增殖,下调则能对上述两种细胞的增殖起到促进作用；miR-454能够将人胶质瘤LN18和T98G细胞周期阻滞在G1/G0期,同时减少人胶质瘤LN18和T98G细胞S期的数量。(3)PDK1为miR-454的靶基因；miR-454的含量增高后能够显著抑制人胶质瘤T98G和LN18细胞中PDK1的表达；miR-454能显著抑制T98G和LN18细胞中PDK1、Cyclin D1、p-pRb蛋白的表达,上调p21蛋白的含量,但对pRb蛋白的表达无显著影响。结论：(1)PDK1蛋白在胶质瘤组织中的表达与临床病理分级呈正相关；(2)miR-454在胶质瘤的发生和发展过程中发挥着抑癌基因的作用；(3)miR-454对胶质瘤细胞增殖的抑制作用是通过抑制PDK1的表达实现的。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

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