上调miR-130b通过灭活Hippo信号通路来增强胶质瘤干细胞的表型

发布时间：2018-02-03 18:47

  本文关键词： miR-130b 胶质细胞瘤 Hippo信号 肿瘤干细胞　出处：《新疆医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:恶性胶质细胞瘤(GBM,世界卫生组织IV级神经胶质瘤)在成年人中它是最常见的恶性的原发性脑肿瘤,它是人类最致命的肿瘤之一。尽管在过去几十年的治疗中不断取得进展,但本病的治疗及预后仍然很差,在美国和欧洲地区5年生存率平均小于3%。最近的研究已经表明,在胶质瘤细胞中,存在着胶质瘤干细胞(CSCs),胶质瘤干细胞能自我分化并不断的更新增殖成胶质瘤细胞,并导致肿瘤不断增殖生长。本研究目的就是鉴于此理论基础,从恶性胶质细胞瘤中分离表达CD133的细胞,通过一系列实验证实其是高度致瘤性,并且有很强的侵袭性和耐化疗性。然而,对于维持胶质瘤干细胞的分子机制在很大程度上仍然未知。有实验报道,在维持肿瘤干细胞的干性上,发现miRNA起到一定的作用,miRNA是一类长度为19~25个核苷酸的非编码单链小RNA分子,参与基因转录后的调节,一般通过靶基因的3’端非翻译区部分互补配对的结合方法来调控目的基因转录水平。研究表明,Hippo信号通路起着限制器官大小和抑制肿瘤发生起至关重要的作用。生物学上表明,Hippo信号通路在很大程度上限制了它的两个下游效应因子YAP和TAZ。而基因MST1-SAV1的活性直接影响到YAP/TAZ的表达水平。在此,我们通过筛查出miR-130b在胶质瘤中的高表达水平,通过过表达miR-130b后来检测Hippo信号通路中的下游信号基因的表达及活性水平,同时检测干细胞标志基因,包括CD133、SOX2、Nanog、MYC和BMI1表达水平,以观察miR-130b对胶质瘤干细胞的影响。这些研究为miR-130b在Hippo信号通路中的作用,以及miR-130b在胶质细胞瘤的发展中的作用提供了一种新的机制,而且为胶质瘤的靶向治疗提供了一种很好的思路。方法:为了检测miR-130b在胶质瘤组织及细胞中表达水平,我们收集胶质瘤组织标本8例,正常组织3例。正常细胞NHA以及胶质瘤细胞SNB19、U87MG、LN444、LN18、U251MG。运用BioTNT生物公司miR-130b检测试剂盒(CL-has-miR-130b)对标本进行检测。同时我们检测了miR-130b对胶质瘤增殖及胶质瘤干细胞成球的作用,将约500个细胞接种在6孔板上以及将约10个细胞接种在24孔板上,用无血清的培养基DMEM/F12培养13天,在培养的过种中加入2%B27,同时加入表皮生长因子20ng/ml,和bFGF 20ng/ml,0.4%牛血清白蛋白(BSA)和为5μg/ml的胰岛素。进行培养后,然后检测其成球的大小,算出其倍数。我们运用WB方法检测了miR-130b对Hippo信号通路中YAP、TAZ蛋白表达的影响,用核蛋白P84抗体作为参照(Sigma美国),同时检测MST1和SAV1蛋白水平,用α-Tubulin抗体作为内参对照(Sigma美国)。用荧光素酶方法检测mi R-130b对TEAD活性的影响,将购买的TEAD质粒在48孔板中共转染胶质瘤细胞,每组设置4个复孔,操作按照LipofectamineTM2000试剂说明书进行,48h后进行荧光素酶检测。运用mi RBASE软件预测miR-130b与MST1/SAV1的调控关系,软件预测miR-130b与MST1/SAV1都存在调控位点,运用荧光素酶的方法,检测miR-130b与基因MST1/SAV1是否存在调控作用,我们构建了MST1/SAV13’端,同时设计突变位点,共转染细胞进行上机检测,测定荧光值。结果:通过参考癌症基因GBM miRNA芯片数据(TCGA),我们发现miR-130b水平明显上调在人脑胶质瘤组织(n=496)与正常脑组织相比(n=10)(P0.001)。通过RT-PCR检测进一步验证了这一结果。mi R-130b水平在8例GBM组织相比,与在3例正常脑组织中显著增加,并与在5种胶质细胞瘤的细胞系相比,在正常的人星形胶质细胞(NHA)显著降低。miR-130b对胶质瘤增殖及胶质瘤干细胞成球的作用,过表达miR-130b有力促进悬浮培养产生大约两倍以上的细胞球。相反,mir-130b-抑制细胞形成的球体不及正常球体的2倍,我们的研究结果表明,miR-130b促进胶质细胞瘤成球的作用。WB法检测蛋白的表达水平得知,过表达miR-130b使YAP、TAZ的表达增高,而抑制miR-130b的表达可以使蛋白YAP、TAZ的表达降低,而核因子P84的表达却没有影响,而过表达miR-130b后,MST1和SAV1蛋白水平降低,这说明miR-130b直接影响了Hippo信号通路基因而发挥相关功能作用。荧光素酶进一步验证了在过表达miR-130b的稳定细胞株SNB19和LN18中,干扰YAP和TAZ的情况下,与阳性对照的顺铂对比,检测的荧光值为1、0.25、0.28和1、0.26、0.39,均有统计学意义(P0.001)。结论:YAP与TAZ均与TEAD有显著的作用,其降低TEAD的活性比顺铂还要强。由mirBASE软件预测miR-130b与MST1/SAV1有调控位点,通过荧光素酶检测提示mi R-130b与MST1/SAV1-3'UTR测得的荧光值显著降低,说明它们之间有结合点,减弱了荧光的表达,而在对照及正常组中,荧光的值没有什么变化,在抑制组中,荧光值增强,提示抑制剂阻止了与MST1/SAV1-3'UTR的结合,这些数据说明miR-130b与MST1/SAV1-3'UTR存在结合的调控位点,这与理论工具预测是一致的。所有的统计分析,进行了用SPSS统计软件。两个样本均数比较采用T进行检验;P值0.05被认为是差异有显著意义。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.41

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 ;Hippo signaling:A hub of growth control,tumor suppression and pluripotency maintenance[J];遗传学报;2011年10期

2 许传铭;万福生;;哺乳动物Hippo信号通路:肿瘤治疗的新标靶[J];遗传;2012年03期

3 李敏睿;张盛洪;钟碧慧;;Hippo信号通路在恶性肿瘤及干细胞中的作用[J];胃肠病学和肝病学杂志;2013年04期

4 朱忠胜;张春林;;肿瘤中Hippo-TAZ信号转导通路研究进展[J];国际骨科学杂志;2013年03期

5 史梦婕;邵松军;李洁媚;周艳芳;黄培春;;Hippo通路与肿瘤相关性研究进展[J];中国细胞生物学学报;2014年03期

6 李桂兰;张丽;闫华超;;Hippo信号通路与肿瘤发生相关性研究进展[J];基础医学与临床;2010年09期

7 鲍乾坤;何金龙;朱毅;;Hippo-YAP通路在心血管系统中的作用[J];生理科学进展;2014年03期

8 Jiliang Zhou;;An emerging role for Hippo-YAP signaling in cardiovascular development[J];The Journal of Biomedical Research;2014年04期

9 Masato Enomoto;Tatsushi Igaki;;Deciphering tumor-suppressor signaling in flies:Genetic link between Scribble/Dlg/Lgl and the Hippo pathways[J];遗传学报;2011年10期

10 张靖;朱金水;;Hippo-YAP信号通路与胃癌相关性研究[J];国际消化病杂志;2011年04期

相关会议论文 前3条

1 Zhan Yang;;MicroRNA-155 and Hippo/STK3 Form a Feedback Loop to Participate in Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation[A];中国生物化学与分子生物学会第十一次会员代表大会暨2014年全国学术会议论文集——专题报告五[C];2014年

2 Hongtan Wu;Luyao Wei;Suyuan Ji;Fuqin Fan;Funiu Qin;Lanfen Chen;Dawang Zhou;;MST1/2-Yap signaling pathway in organ size control and cancer development[A];生命的分子机器及其调控网络——2012年全国生物化学与分子生物学学术大会摘要集[C];2012年

3 Zhan Yang;Bin Zheng;Yu Zhang;Xin-hua Zhang;Ming He;Dong Ma;Jin-kun Wen;;MicroRNA-155 and Hippo/STK3 Form a Feedback Loop to Participate in Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation[A];第十二届全国脂质与脂蛋白学术会议论文汇编[C];2014年

相关重要报纸文章 前2条

1 记者 胡德荣;我学者发现原癌蛋白质YAP抑制剂[N];健康报;2014年

2 记者 徐瑞哲;人造“克星”抑制胃癌[N];解放日报;2014年

相关博士学位论文 前10条

1 安健;Nedd4-like E3泛素连接酶调控Angiomotin/p130蛋白稳定性的分子机制研究[D];复旦大学;2011年

2 刘欢;Hippo通路效应蛋白YAP调控基因转录的机制与功能研究[D];浙江大学;2015年

3 刘鹏;HBV preS2 通过miR-338-3p 调控Hippo通路效应分子TAZ促进肝细胞肝癌作用研究[D];山东大学;2015年

4 朱国华;上调miR-130b通过灭活Hippo信号通路来增强胶质瘤干细胞的表型[D];新疆医科大学;2015年

5 周鑫;Hippo-TAZ信号通路的分子调控机制[D];复旦大学;2013年

6 胡文娟;Hippo通路在常染色体显性多囊肾病发病机制中的作用研究[D];第二军医大学;2012年

7 张国飞;Hippo信号通路调控心肌细胞增殖机制研究[D];浙江大学;2012年

8 叶亚平;Hippo-YAP通路调控脂肪干细胞增殖和细胞谱系选择的分子机制研究[D];华中科技大学;2014年

9 李泽;Hippo信号通路下游转录因子复合物YAP-TEAD的结构与功能研究[D];复旦大学;2009年

10 安杨;Lats2通过Hippo信号通路调控脂肪细胞增殖和分化的分子机制研究[D];中国农业大学;2013年

相关硕士学位论文 前8条

1 梁坤;Hippo信号通路在结直肠癌中的表达及临床意义[D];青岛大学;2014年

2 魏文超;Hippo信号通路在胃粘膜癌变过程中的作用[D];青岛大学;2013年

3 向晟;Hippo通路主要组分与小鼠原始卵泡池大小的时序相关性研究[D];南昌大学;2014年

4 钱莹;家蚕Hippo信号通路主要基因的研究[D];苏州大学;2014年

5 沈龙霞;HCMV经Hippo-YAP信号通路对绒毛外细胞滋养细胞功能影响的体外研究[D];泰山医学院;2014年

6 陈柯宏;LATS1基因去甲基化对人肾癌细胞生物学功能及其Hippo-YAP信号通路的影响[D];重庆医科大学;2014年

7 尹聪;Hippo通路与自噬共调节IUGR新生仔猪肝脏代谢的机理研究[D];华中农业大学;2013年

8 张玉龙;Hippo信号通道中Lats1基因对湖羊肌肉生长性状遗传调控的初步研究[D];扬州大学;2013年

，

本文编号：1488088