西红花酸对人食管鳞癌KYSE-150细胞的抑制作用及其机制

发布时间：2018-02-15 23:52

  本文关键词： 西红花酸 KYSE-150细胞 凋亡 PI3K/Akt MAPK p53/p21 西红花酸 顺铂 协同作用 凋亡 p53/p21　出处：《中山大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：食管癌是消化道常见的恶性肿瘤,其发病率在所有恶性肿瘤中,居世界第8,致死率居第6。我国更是世界食管癌第一高发国家,每年食管癌新发病例数约占全球总例数的50%。据报道2012年全球约有新增45万例食管癌患者,同年死亡40万例患者;我国同年新增22.3306万例,死亡19.7472万人,几近一半的食管癌病例出现在我国。中国食管癌的流行具有显著地理分布差异,广东省特别是粤东地区,食管癌的发病率居高不下。食管癌的致死率极高,预后差,5年生存率低于13%。由于食管癌早期临床症状不典型和缺乏有效的筛查手段,大部分患者发现时已处于中晚期,已有不同程度的癌细胞转移。因此,化疗仍是治疗食管癌的重要手段。但是化疗药物大都存在严重的不良反应,很多病人因为不能耐受不良反应而不得不停止化疗。此外,病人对化疗药物产生耐药性也是临床治疗癌症的一大难题,如顺铂首次剂量效应显著,但随着化疗时间延长或癌症复发后,顺铂的药效显著降低。因此,寻求新型、高效、不易产生耐药性的以及不良反应小的食管癌药物是研究的热点之一。近年来,利用天然植物或从天然植物中提取有效成分来治疗肿瘤引起了人们的关注。西红花酸是从中药西红花中提取出来的有效物质,是一种多不饱和共轭烯酸,属类胡萝卜素类。已有文献报道西红花酸对胃癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌等具有抑制作用,但尚未报道对食管癌是否有抑制作用。因此,本实验分为两部分:第一部分探讨西红花酸对人食管鳞癌KYSE-150细胞的抑制作用;第二部分研究西红花酸联合顺铂对人食管鳞癌KYSE-150细胞的影响及其机制。第一部分西红花酸对人食管鳞癌KYSE-150细胞的抑制作用及机制研究目的:本实验以人食管鳞癌KYSE-150细胞为食管癌的体外模型,探讨西红花酸对食管癌的抑制作用及其机制。方法:用MTT法检测不同浓度西红花酸对人食管鳞癌KYSE-150细胞的增殖抑制作用;Annexin V/PI染色结合倒置荧光显微镜下观察细胞形态学变化;PI染色流式细胞术检测细胞周期;Rh123染色检测细胞线粒体膜电位MMP变化;Western blot法检测PI3K/Akt、MAPK、p53/p21信号通路的变化,以及Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白的表达水平。结果:1.西红花酸呈浓度时间效应抑制KYSE-150细胞增殖50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L浓度的西红花酸在作用24h后即能显著抑制细胞增殖,细胞存活率分别是(77.78±4.51)%、(72.33±1.49)%、(58.13±4.86)%,较对照组差异有统计学意义(P0.05)。低浓度(12.5μmol/L、25μmol/L)西红花酸则对KYSE-150细胞无抑制作用。当西红花酸作用时间延长至48h后,25μmol/L浓度西红花酸亦可以抑制KYSE-150细胞的增殖。25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L浓度的西红花酸处理48h后,其生存率分别是(91.81±4.83)%、(76.62±4.62)%、(63.45±5.51)%和(50.64±5.54)%,较对照组差异有统计学意义(P0.05)。12.5μmol/L西红花酸作用72h后也表现出显著的增殖抑制作用。12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L浓度的西红花酸处理72h后,其生存率分别是(90.27±3.51)%、(74.94±4.78)%、(65.86±4.47)%、(54.02±4.03)%和(43.07±1.15)%,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。西红花酸作用KYSE-150细胞24h、48h、72h后,IC50分别是347.101μmol/L、186.205μmol/L、125.812μmol/L。2.西红花酸有诱导KYSE-150细胞凋亡的作用普通光镜下正常对照组KYSE-150细胞贴壁性良好,胞体饱满呈多边形,胞质清晰,边界清楚。加入100μmol/L浓度西红花酸孵育48h后,细胞生长明显受到抑制,细胞密度明显低于对照组,且细胞皱缩,变圆,细胞边界模糊,胞质不清晰,培养液中出现颗粒物质。200μmol/L浓度西红花酸组细胞损伤更为严重,细胞数量急剧减少,且大部分细胞皱缩,胞质不清,形态不规则,甚者部分细胞漂浮于培养液中。Annexin V-FITC/PI染色荧光显微镜下对照组细胞无荧光或仅有极少数细胞出现苹果绿色细胞膜或黄红色的细胞核。经西红花酸作用后凋亡细胞增多,表现为细胞膜呈现苹果绿色,或细胞核呈黄红色。200μmol/L浓度西红花酸组凋亡细胞更多。3.西红花酸诱导KYSE-150细胞S期阻滞PI染色结合流式分析,结果显示100μmol/L、200μmol/L浓度西红花酸均能够诱导KYSE-150细胞发生S期阻滞。100μmol/L、200μmol/L浓度西红花酸组S期细胞所占百分比分别为(17.73±0.56)%、(23.33±0.88)%,与对照组(12.93±0.41)%相比显著增加(P0.05)。与此同时,西红花酸组G0/G1期和M期细胞数量显著下降。说明西红花酸具有将KYSE-150细胞阻滞于S期的作用。4.西红花酸降低KYSE-150细胞线粒体膜电位Rh123染色后荧光显微镜下分析,显示200μmol/L西红花酸处理48h后,KYSE-150细胞线粒体对Rh123摄取显著降低(P0.05),其平均荧光强度降到(78.39±1.58)%,提示线粒体膜电位降低。表明西红花酸可降低细胞线粒体膜电位。5.西红花酸调节KYSE-150细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3的表达西红花酸作用48h后,细胞体内促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3表达上升,促生存蛋白Bcl-2表达下降。100μmol/L、200μmol/L浓度西红花酸组细胞内Bax蛋白的表达水平分别是(72.20±7.54)%和(79.43±9.85)%,较对照组(45.84±2.97)%显著上升(P0.05)。Cleaved caspase-3蛋白表达水平也明显上升(P0.05),对照组和100μmol/L、200μmol/L浓度西红花酸组分别是(28.93±6.25)%、(71.85±7.56)%和(90.58±5.87)%。与此同时,西红花酸处理组细胞内的Bcl-2蛋白表达水平受到了抑制,100μmol/L、200μmol/L浓度西红花酸组分别是(66.0±9.54)%和(56.90±6.73)%较对照组(93.10±9.57)%,明显降低(P0.05)。6.西红花酸抑制KYSE-150细胞内PI3K/AKT信号通路的表达西红花酸作用48h后,细胞体内PI3K、Akt磷酸化受到抑制。对照组、100μmol/L、200μmol/L浓度西红花酸组细胞内磷酸化PI3K蛋白的表达水平分别是(116.07±6.07)%、(100.76±5.74)%、(66.91±4.60)%,其中200μmol/L浓度西红花酸组较对照组显著下降(P0.05),具有统计学意义。磷酸化Akt蛋白表达水平也明显受到抑制(P0.05),对照组和100μmol/L、200μmol/L浓度西红花酸组分别是(143.72±4.60)%、(112.94±2.03)%、(82.90±1.47)%。7.西红花酸抑制KYSE-150细胞内ERK1/2,P38磷酸化水平西红花酸显著下调了磷酸化的ERK1/2和磷酸化P38蛋白表达。西红花酸处理细胞48h后,200μmol/L浓度西红花酸组细胞体内ERK1/2磷酸水平(27.82±9.76)%,较对照组(87.30±6.62)%显著下降(P0.05)。但100μmol/L浓度西红花酸组与对照组无明显变化。100μmol/L、200μmol/L浓度西红花酸组细胞内磷酸P38水平分别为(64.41±4.19)%、(34.17±7.87)%较对照组(89.12±2.40)%显著下降(P0.05)。但不管是100μmol/L还是200μmol/L浓度西红花酸组细胞内磷酸化JNK与对照组比较均无变化。8.西红花酸激活KYSE-150细胞内p53/p21信号通路的表达西红花酸处理48h后,100μmol/L、200μmol/L浓度西红花酸组细胞内p53蛋白的表达水平分别是(46.32±3.06)%和(53.23±5.14)%,较对照组(29.22±3.71)%显著上升(P0.05)。P21蛋白表达水平也明显上升(P0.05),对照组和100μmol/L、200μmol/L浓度西红花酸组分别是(40.89±3.98)%、(66.39±8.46)%、(79.66±5.68)%。结论:1.西红花酸可能具有抑制人食管鳞癌KYSE-150细胞增殖,促进细胞凋亡,诱导S期阻滞的作用。2.西红花酸可能通过抑制PI3K/AKT信号通路,抑制ERK1/2、P38磷酸化,激活p53/p21信号通路,进而激活线粒体介导的凋亡途径降低细胞线粒体膜电位,上调Bax、cleaved caspase-3,下调Bcl-2表达,诱导细胞凋亡。第二部分西红花酸联合顺铂对人食管鳞癌KYSE-150细胞的影响及机制目的:探讨西红花酸联合顺铂对人食管鳞癌KYSE-150细胞的作用及机制研究。方法:MTT法检测不同浓度顺铂对KYSE-150细胞的影响,挑选出合适顺铂浓度。再用MTT法检测西红花酸、顺铂单独或联合作用对KYSE-150细胞增殖的影响。Annexin V/PI染色结合倒置显微镜下观察细胞形态学变化;Rh123染色检测细胞线粒体膜电位MMP变化;Western blot法检测PI3K/Akt、MAPK、p53/p21信号通路的变化,以及Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白的表达水平。结果:1.西红花酸联合顺铂协同抑制KYSE-150细胞增殖不同浓度顺铂对KYSE-150细胞具有增殖抑制作用且呈浓度时间效应关系。考虑临床顺铂实际应用中的不良反应,及有效性,我们选用2μg/m L浓度顺铂作为后续实验工作浓度。KYSE-150细胞经过西红花酸、顺铂、西红花酸联合顺铂作用24h、48h、72h后西红花酸联合顺铂组的细胞生存率分别是(44.82±2.22)%、(29.28±2.21)%和(20.42±1.28)%,较西红花酸(58.13±4.86)%、(50.64±5.54)%和(43.07±1.15)%,顺铂(80.01±3.51)%、(63.86±3.81)%和(28.00±1.26)%显著抑制(P0.05)。西红花酸联合顺铂组细胞增殖抑制作用显著强于西红花酸或顺铂单独作用组,且呈现出明显的时间效应关系。2.西红花酸联合顺铂协同诱导KYSE-150细胞凋亡普通光镜下和Annexin V/PI染色荧光显微镜下,观察西红花酸联合顺铂对KYSE-150细胞的影响。普通光镜下正常对照组KYSE-150细胞贴壁性良好,胞体饱满呈多边形,胞质清晰,边界清楚,细胞立体感明显。顺铂组细胞较正常对照组细胞数量减少,胞体肿胀,胞质不清晰,细胞边界模糊。西红花酸组细胞生长明显受到抑制,细胞密度明显低于对照组,且细胞皱缩,变圆,细胞边界模糊,胞质不清晰,培养液中出现颗粒物质。西红花酸联合顺铂组细胞损伤最为严重,细胞皱缩变圆,细胞形态不规则,细胞边界不清,大量细胞脱落漂浮在培养液中。3.西红花酸联合顺铂协同降低KYSE-150细胞线粒体膜电位西红花酸、顺铂单独或联合作用48h后,KYSE-150细胞摄取Rh123显著降低,西红花酸联合顺铂组Rh123荧光强度为(73.27±0.35)%,较顺铂组(81.98±1.94)%显著降低(P0.05),与西红花酸组(82.12±1.14)%相比也明显降低(P0.05)。4.西红花酸联合顺铂协同上调KYSE-150细胞内促凋亡蛋白cleaved caspase-3表达,下调Bcl-2蛋白表达西红花酸、顺铂、西红花酸联合顺铂作用48h后,西红花酸联合顺铂组细胞内Bcl-2表达水平为(30.70±4.53)%较西红花酸组(66.66±3.43)%显著降低(P0.05),与顺铂(89.36±17.84)%组相比也显著下调(P0.05)。西红花酸联合顺铂组细胞内Bax表达水平为(129.71±5.40)%,与西红花酸组(96.85±7.62)%相比显著上升(P0.05),但与顺铂组(125.93±1.98)%相比无明显变化。西红花酸联合顺铂组细胞内cleaved caspase-3表达水平为(122.59±10.59)%,较西红花酸(85.13±8.74)%显著增多(P0.05),与顺铂组(74.19±3.71)%相比也显著上升(P0.05)。5.西红花酸联合顺铂激活KYSE-150细胞内p53/p21信号通路的表达西红花酸、顺铂、西红花酸联合顺铂作用KYSE-150细胞48h后。西红花酸联合顺铂组细胞内p53、p21表达水平分别为(118.57±2.21)%、(109.30±4.82)%,与顺铂组(99.51±3.25)%、(85.77±5.90)%,西红花酸组(59.05±9.21)%、(87.16±2.74)%,显著升高(P0.05)。6.P53抑制剂PFT-α可部分逆转西红花酸联合顺铂的协同作用加入p53抑制剂PFT-α后,PFT-α+西红花酸+顺铂组细胞活力为(34.03±2.10)%较西红花酸联合顺铂(23.42±1.01)%显著升高(P0.05),细胞凋亡也明显减少。PFT-α+西红花酸+顺铂组Rh123荧光强度为(87.94±2.79)%,较西红花酸联合顺铂组(66.44±1.84)%明显升高(P0.001)。PFT-α+西红花酸+顺铂组细胞Bcl-2蛋白表达为(93.41±11.17)%,较西红花酸联合顺铂组(60.32±9.15)%显著上升(P0.05)。PFT-α+西红花酸+顺铂组细胞cleaved caspase-3蛋白表达为(146.64+8.47)%,较西红花酸联合顺铂组(173.30±5.74)%显著下降(P0.05)。表明PFT-α可抑制西红花酸联合顺铂协同引起的增殖抑制,促进凋亡,膜电位降低,促凋亡蛋白表达。结论:1.西红花酸联合顺铂对人食管鳞癌KYSE-150细胞可能具有增殖抑制,降低MMP,促进凋亡相关蛋白表达,诱导细胞凋亡作用。2.西红花酸联合顺铂的协同作用,可能是通过调节p53/p21信号通路来实现的,使用p53抑制剂能部分逆转西红花酸联合顺铂的协同增殖抑制作用、降低MMP、促进凋亡相关蛋白表达、诱导细胞凋亡作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中山大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1
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本文编号：1514173