ALKBH与前列腺癌关系的初步研究

发布时间：2018-03-03 05:36

本文选题：前列腺癌　切入点：ALKBH　出处：《郑州大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的近年来我国前列腺癌的发病率急速上升,已经成为泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。晚期前列腺癌经过内分泌治疗后转化为雄激素非依赖性前列腺癌之后目前尚无有效的方法治疗以使患者长期生存,基因治疗有可能会成为一种有前景的治疗方法。ALKBH是一种DNA损伤修复蛋白,此前的研究发现其在前列腺癌中表达水平较高,且与肿瘤细胞的增殖、凋亡及侵袭相关。本实验采用RNA沉默技术通过抑制ALKBH基因的表达,观察前列腺癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的变化;并统计分析ALKBH基因表达水平与患者预后之间的关系。为ALKBH的临床应用及作为基因治疗靶点的可行性提供实验依据。方法采用半定量RT-PCR和免疫印迹技术筛选ALKBH表达水平最高的前列腺癌细胞系,利用软件设计靶向ALKBH基因mRNA的干扰序列,应用BLAST软件分析各条干扰序列的二级结构及同源性从中筛选3条最佳的干扰片段。人工合成靶向ALKBH的siRNA转录模板后与质粒载体连接,成功构建3个RNA沉默重组质粒,命名为pSIREN-ALKBH-shRNA-1、2、3。在脂质体的介导下将重组质粒转染给前列腺癌细胞,采用免疫印迹技术和半定量RT-PCR检测前列腺癌细胞ALKBH的表达情况,选取沉默效果最佳的重组质粒进行后续实验,将该重组质粒转染前列腺癌细胞后,采用流式细胞仪和Transwell小室技术分别检测前列腺癌细胞的细胞周期的变化,和侵袭能力的变化。同时采用半定量RT-PCR和免疫印迹技术检测前列腺癌细胞中c-Myc含量。制备前列腺癌裸鼠移植瘤动物模型,在瘤体局部注射针对ALKBH基因的RNA干扰质粒及脂质体的混合物,观察移植瘤的生长情况,采用半定量RT-PCR、免疫印迹技术和免疫组化检测瘤组织中ALKBH的表达情况。采用免疫组化法检测患者前列腺癌和良性前列腺增生组织中ALKBH的表达,分析其表达水平与患者临床病理特点及预后的关系。结果采用半定量RT-PCR分别检测三种RNAi重组质粒转染的前列腺癌LNCaP细胞后,结果示:细胞中ALKBH的mRNA的相对表达量分别为0.412±0.05、0.189±0.01与0.134±0.02,与阴性对照组(1.099±0.12)及空质粒组(0.991±0.15)相比,差异均有统计学意义(P0.05),后两种重组质粒的沉默效果更佳,与第一组重组质粒比较差异有统计学意义(P0.05)。Western blot检测阴性对照组、空质粒组及pSIREN-ALKBH-shRNA-2、3重组质粒组中ALKBH蛋白的相对表达量分别为0.755±0.12、0.812±0.19、0.157±0.07、0.112±0.04。两种重组质粒与阴性对照组及空质粒组相比,差异均有统计学意义(P0.05),比较之下,第三种重组质粒的沉默效果更佳。将pSIREN-ALKBH-shRNA-3重组质粒转染前列腺癌LNCaP细胞,48小时后实验组前列腺癌LNCaP细胞中ALKBH的染色强度、阳性细胞所占比例较对照组明显减弱,差异有统计学意义(P0.05)。阴性对照组、空质粒组与实验组前列腺癌LNCaP细胞中c-Myc的mRNA的相对表达水平分别为0.103±0.018,0.101±0.012和0.092±0.015。三组前列腺癌LNCaP细胞中c-Myc的表达水平差异无统计学意义(P0.05)。阴性对照组、空质粒组与实验组前列腺癌LNCaP细胞中c-Myc蛋白的相对表达水平分别为0.775±0.09、0.796±0.12和0.275±0.05,实验组前列腺癌LNCa P细胞中c-Myc蛋白的表达水平显著下降,与阴性对照组和空质粒组比较,差异有统计学意义(P0.05)。实验组前列腺癌LNCaP细胞增殖速度明显低于阴性对照组及空质粒组,差异有统计学意义(P0.05)。Transwell小室结果表明转染重组质粒后前列腺癌LNCaP细胞穿透小室到达对侧的迁徙细胞数与对照组相比明显减少,差异有统计学意义(P0.05)。阴性对照组、空质粒组和实验组前列腺癌LNCaP细胞中G0/G1期细胞所占比例分别为为(71.53±1.13)%、(69.78±1.23)%和(31.04±1.01)%,实验组前列腺癌LNCaP细胞中G0/G1期细胞所占比例最低,差异有统计学意义(P0.05)。S期细胞所占比例为(19.26±0.88)%、(20.54±0.67)%及(51.23±1.25)%,实验组前列腺癌LNCaP细胞中S期细胞所占比例最高,差异有统计学意义(P0.05)。阴性对照组、空质粒组和实验组细胞的凋亡率分别为(2.21±1.65)%、(2.27±1.56)%及(6.28±1.56)%,差别有统计学意义(P0.05)。将重组干扰质粒注射到裸鼠移植瘤的局部,可见实验组的移植瘤生长速显著显减缓,与阴性对照组、空质粒组相比较,差异有统计学意义(P0.05)。阴性对照组、空质粒组和实验组瘤组织中ALKBH mRNA的相对表达量分别为0.088±0.016,0.112±0.022和0.043±0.005。实验组瘤组织中ALKBH mRNA的相对表达量显著较低,与阴性对照组和空质粒组比较,差异有统计学意义(P0.05)。阴性对照组、空质粒组和实验组瘤组织中ALKBH蛋白的相对表达量(ALKBH/GAPDH的灰度值比值)分别为0.884±0.11,0.775±0.18和0.135±0.07。实验组瘤组织中ALKBH蛋白的相对表达量较低,与阴性对照组和空质粒组比较,差异有统计学意义(P0.05)。阴性对照组、空质粒组和实验组瘤组织中细胞的ALKBH蛋白阳性表达率分别为82.6%、79.8%和45.1%。实验组瘤组织中细胞的ALKBH蛋白阳性表达率最高,与其他两组比较差异有统计学意义(P0.05)。采用Kaplan Meier单因素回归分析软件对前列腺癌患者进行统计结果显示ALKBH蛋白表达水平与患者预后密切相关(P0.05)。结论本实验构建成功针对ALKBH的重组干扰质粒,将重组质粒转染前列腺癌LNCaP细胞后可以检测到细胞内ALKBH的mRNA及蛋白的表达水平均明显下降,细胞的细胞周期受到阻滞、增殖受到抑制、凋亡增加、侵袭能力下降。应用重组质粒可以抑制裸鼠移植瘤的生长、且瘤组织中ALKBH的表达显著降低。ALKBH与患者的总体生存率呈负相关,是影响前列腺癌患者总体生存率的独立预后因素,可以作为基因治疗前列腺癌的靶点之一,具有临床应用价值。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.25

【参考文献】