锌影响前列腺癌细胞系PC-3的化疗敏感性及外源性p53稳定性的实验研究

发布时间：2018-03-08 18:42

  本文选题：p53　切入点：锌　出处：《吉林大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：前列腺癌病人多好发于60岁以上的老年人,转移率高而且发现就已是晚期,所以化学治疗是治疗前列腺癌的主要方法。大约有一半以上的前列腺癌患者中存在p53突变或者失活,p53的状态决定了化疗药物对于前列腺癌的敏感性;前列腺癌中锌的浓度要比正常的前列腺组织低很多,我们推测前列腺癌中锌浓度降低有可能与p53功能丧失和化疗抵抗有关。本实验涉及两方面的内容,先通过外源补充锌来探讨锌是否增强前列腺癌PC-3细胞对于化疗药物紫杉醇的敏感性,接着又在细胞中导入了一种表达野生型p53与抑制MDM2的共表达质粒Pmp53,探讨锌对外源性p53稳定性的影响。[目的]1.在前列腺癌PC-3细胞系中补充微量元素锌,研究锌是否能增强紫杉醇的化疗敏感性;2.在细胞中导入Pmp53,研究锌对细胞内外源性p53稳定性的影响。[方法]一、锌对PC-3细胞内紫杉醇化疗敏感性的影响实验分组:对照组,锌组,紫杉醇组,锌+紫杉醇组。MTT方法确定PC-3细胞中锌联合紫杉醇的最佳浓度,形态学分析锌联合紫杉醇对于细胞形态的影响,克隆形成实验分析细胞的增殖能力,免疫荧光实验分析细胞凋亡及增殖能力,流式细胞术检测各组的凋亡情况及线粒体膜电势的高低,PCR以及Western-blot实验检测Bax,Bcl-2,Cleaved-caspase3,Cleaved-caspase9及MDM2等凋亡相关基因和蛋白表达水平的变化。二、锌对外源性p53稳定性的影响在PC-3细胞中导入一种表达野生型p53及抑制MDM2的共表达质粒Pmp53,实验分组:对照(Control)组,锌(Zn)组,Pmp53组,Pmp53+Zn组,TPEN组,Pmp53+TPEN组,Pmp53+Zn+TPEN组。PCR以及Western-blot实验检测各组p53及MDM2基因及蛋白水平的变化,免疫共沉淀实验检测p53与MDM2的结合能力,环己酰亚胺(CHX)捕获实验检测MDM2以及p53的半衰期。[结果]一、锌增强PC-3细胞的化疗敏感性1)MTT结果显示10nmol/L紫杉醇联合250μmol/L锌能够明显抑制PC-3细胞的增殖(P0.05)。细胞克隆形成实验及免疫荧光KI-67染色观察到与对照组、锌组、紫杉醇组相比,锌联合紫杉醇组能够明显抑制细胞的增殖能力(P0.05);Annexin V-FITC流式细胞术及免疫荧光Hochest染色发现与对照组、锌组、紫杉醇组相比,锌联合紫杉醇组能够明显促进细胞发生凋亡(P0.05);JC-1染色发现与对照组、锌组、紫杉醇组相比,锌联合紫杉醇组能够明显降低细胞内线粒体的膜电位(P0.05)。2)RT-PCR实验发现与对照组、锌组、紫杉醇组相比,锌联合紫杉醇组能够明显降低细胞内Bcl-2及MDM2的基因表达水平,能够明显增强Bax、caspase3及caspase9的基因表达水平(P0.05)。Western-blot实验发现与对照组、锌组、紫杉醇组相比,锌联合紫杉醇组能够明显降低细胞内Bcl-2的蛋白表达水平、及原癌基因MDM2的蛋白表达水平;能够明显增强Bax、Cleaved-caspase3及Cleaved-caspase9的蛋白表达水平。(P0.05)。二、锌增强了外源性p53的稳定性PCR以及Western-blot实验发现与Pmp53组相比,Pmp53+Zn组中p53的m RNA表达水平无明显变化,p53的蛋白表达水平明显增强,也就是说锌可能稳定了p53蛋白的翻译后修饰方式。免疫共沉淀实验发现与Pmp53组相比,Pmp53+Zn组中与MDM2结合的p53蛋白表达量明显降低,与Pmp53+Zn组相比,Zn+Pmp53+TPEN组与MDM2结合的p53的蛋白表达量明显增高;说明加入锌之后p53与MDM2的结合能力明显降低,MDM2对p53的泛素化降解水平减弱,也就是说锌稳定了p53蛋白的表达水平。环己酰亚胺捕获实验发现与Pmp53组相比,Pmp53+Zn组p53的半衰期明显延长,也进一步说明锌稳定了p53蛋白的表达。[结论]1.锌联合紫杉醇能够明显抑制前列腺癌PC-3细胞增殖,促进细胞发生凋亡。说明锌增强了PC-3细胞对于紫杉醇的化疗敏感性。2.锌降低了MDM2对于外源性p53的泛素化降解,延长了p53的半衰期。说明锌可增强细胞内外源性p53的稳定性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.25

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本文编号：1585100