3,6-二羟黄酮抑制乳腺癌细胞上皮—间质转化的效应及分子机制研究

发布时间：2018-03-08 19:21

本文选题：3　切入点：6-DHF　出处：《第三军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：乳腺癌(breast cancer,BC)作为女性最常见的恶性肿瘤,已经严重威胁到全世界女性的身心健康,给社会和家庭带来了沉重的负担。因此,关于乳腺癌的防治研究就显得尤为重要。流行病学调查研究发现,膳食因素与乳腺癌的发生发展息息相关。课题组前期利用药效学实验方法,对常见的类黄酮化合物进行筛选,发现3,6-二羟黄酮(3,6-dihydroxyflavone,3,6-DHF)能够显著抑制肿瘤的发生发展,其抗肿瘤活性较强。3,6-DHF广泛存在于蔬菜水果中,其抗肿瘤活性由许多实验研究所证实,但其具体机制仍不是非常清楚。在肿瘤的发生发展中,上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)发挥关键性作用。EMT的分子过程十分复杂,主要表现在E-cadherin(E-钙黏蛋白)表达降低,Snail、Slug、Twist和N-cadherin表达升高。EMT与肿瘤的发生发展密切相关,许多研究已经证明,EMT激活后,可促进许多肿瘤(乳腺癌、胃癌、前列腺癌、宫颈癌等)的生长和转移。众所周知,乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSCs)是一类自我更新能力和多向分化能力强的多潜能细胞,在肿瘤复发、耐药性、抗化疗性及转移中发挥关键性作用。乳腺癌细胞中,具有ALDH+表型或CD44+CD24-表型的细胞表现出干细胞特性,自我更新与多向分化能力强,为肿瘤的防治研究带来了挑战。近期研究表明EMT在肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)形成环节发挥了关键性作用,EMT可以促进肿瘤干细胞的产生,CSCs也可以通过一些相关的信号通路促进肿瘤细胞的EMT,两者相互依赖、相互促进。本研究发现3,6-DHF可从体内外有效地抑制乳腺癌细胞发生EMT,显著抑制肿瘤干细胞的形成和增长,同时通过体内模型证实3,6-DHF抑制乳腺癌细胞发生肺转移。调控EMT的信号通路有很多种,Notch信号通路在其中发挥了重要的作用。最近的研究表明,激活Notch信号通路,可有效地促进肿瘤细胞发生EMT和BCSCs的形成,在乳腺癌发生EMT过程中发挥核心作用。Notch信号通路活化后,Notch受体与Jagged配体结合后,在γ-分泌酶的作用下,释放NICD(Notch1活化胞内域)。NICD-MAML(mastermind-like)-CSL(C-promoter binding factor-1)复合体活化后,促进下游靶基因的表达,从而促进EMT。其中,乳腺癌的发生发展中,也会涉及一系列mi RNA的表达变化。研究发现,P53的转录调节靶点mi R-34a,可直接与Notch1的m RNA结合,抑制Notch信号通路,进而抑制肿瘤细胞的生长。基于上述分析,我们提出研究假说:3,6-DHF可能通过抑制Notch信号通路,抑制乳腺癌发生EMT。本研究探讨3,6-DHF能否通过增强mi R-34的表达来调节Notch信号通路的相关蛋白的表达。阐明3,6-DHF通过调控Notch信号通路,抑制乳腺癌发生EMT进而抑制乳腺癌发生的机制。本课题通过蛋白免疫印迹(western blot,WB)和免疫荧光技术(immunofluorescence analysis,IF)分析3,6-DHF对乳腺癌细胞EMT标志蛋白及Notch信号通路相关蛋白的表达的影响。使用转染荧光报告基因的MDA-MB-231细胞(Luc-MDA-MB-231)构建裸鼠移植瘤模型,利用活体成像仪(IVIS),定量分析3,6-DHF对移植瘤荧光量表达的抑制效应。通过免疫组化技术(immunohistochemical analysis,IHC)分析3,6-DHF对乳腺移植瘤EMT标志蛋白和Notch通路相关蛋白表达的影响。采用ALDEFLOUR○R分析法、微球体成球实验和CCK-8(cell counting kit-8)法分析3,6-DHF对BCSCs的抑制效应。利用Transwell侵袭和迁移实验、细胞划痕实验明确3,6-DHF抑制体外乳腺癌细胞的转移能力。利用Luc-MDA-MB-231细胞,构建裸鼠体内肺转移模型,通过活体成像仪和HE染色(hematoxylin-eosin staining)观察3,6-DHF膳食干预对体内乳腺癌细胞的转移能力的抑制效应。利用WB技术,观察3,6-DHF对NICD-CSL-MAML转录复合体的抑制。采用WB、转染及Transwell迁移和侵袭实验等技术进一步明确3,6-DHF通过调控mi R-34a抑制Notch信号通路及下游蛋白Snail、Twist、Slug和E-cadherin的表达,进而抑制乳腺癌发生EMT的作用。实验结果:1.3,6-DHF抑制乳腺癌细胞EMT和BCSCs的形成(1)WB结果显示:不同浓度3,6-DHF(0μM、5μM、10μM和20μM)处理乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞,随3,6-DHF浓度增加,EMT标志蛋白E-cadherin的表达逐渐增强,N-cadherin、Twist、Snail和Slug的表达逐渐减弱。TGF-β(10ng/ml)可显著增强EMT相关蛋白的表达。同样,免疫荧光结果显示,3,6-DHF剂量增加,Snail表达水平逐渐降低,E-cadherin表达水平逐渐升高。(2)Luc-MDA-MB-231皮下接种到BALB/c雌性裸鼠肩胛下,构建裸鼠移植瘤模型。分别在接种后1W、2W和4W时,用活体成像仪对裸鼠移植瘤荧光量进行定量分析。结果显示3,6-DHF(20mg/kg)组裸鼠移植瘤荧光量高于对照组,并且随着3,6-DHF作用时间的延长,裸鼠移植瘤荧光量逐渐增加。取出4W处理后的裸鼠移植瘤进行称重、测量体积,结果表明3,6-DHF(20mg/kg)组移植瘤体积和重量明显小于对照组。免疫组化染色结果显示3,6-DHF(20mg/kg干预显著降低Snail、Twist和Slug的表达,增加E-cadherin的表达。(3)流式细胞仪分析结合ALDEFLOUR○R分析法检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞中ALDH+细胞的比例,结果显示随着3,6-DHF浓度增加,ALDH+细胞的比例逐渐下降,3,6-DHF降低BCSCs的比例。微球体成球实验结果显示3,6-DHF可以明显抑制乳腺癌细胞的成球能力。CCK-8试剂盒测定乳腺癌细胞MDA-MB-231和SUM-159中ALDH+细胞的活力,结果显示随着3,6-DHF浓度的增加,乳腺癌干细胞的活力明显降低。(4)流式细胞技术检测BALB/c裸鼠移植瘤BCSCs的比例。3,6-DHF(20mg/kg)组移植瘤BCSCs的比例明显低于对照组。提取对照组和3,6-DHF(20mg/kg)组的移植瘤细胞,皮下接种到NOD/SCID小鼠,观察NOD/SCID小鼠成瘤情况。结果显示:对照组的6只小鼠中有5只成瘤,而3,6-DHF处理组仅有1只小鼠成瘤。2.3,6-DHF体内外抑制乳腺癌细胞的转移和侵袭(1)Transwell迁移实验结果显示随着3,6-DHF浓度的增加,穿过聚碳酸酯膜的肿瘤细胞的数量明显降低,并且穿过聚碳酸酯膜的MDA-MB-231细胞的数量要高于MCF-7细胞的数量。Transwell侵袭实验结果显示,穿过聚碳酸酯膜的MDA-MB-231细胞的数量比MCF-7细胞的数量多,并且随3,6-DHF浓度的增加,细胞数量降低。细胞划痕实验结果显示,乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7的划痕愈合率随3,6-DHF浓度的增高,逐渐下降,并且两种乳腺癌细胞的划痕愈合率在24h时明显高于12h。(2)通过尾静脉注射Luc-MDA-MB-231细胞(1×106)于BALB/c裸鼠内,构建裸鼠体内肺转移模型。3,6-DHF(20mg/kg)处理5周后,结果显示对照组中5只裸鼠全部发生肺转移,而3,6-DHF实验组仅有1只发生肺转移。处死裸鼠,分别取出对照组、3,6-DHF(20mg/kg)组和未进行任何处理的裸鼠肺组织,HE染色结果显示对照组裸鼠肺组织出现明显的肺转移结节,未进行任何处理的裸鼠肺组织和未发生肺转移的裸鼠肺组织中均未发现明显的转移结节。3.Notch信号通路在3,6-DHF抑制乳腺癌细胞EMT中的作用(1)WB结果显示乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞中,随3,6-DHF浓度的增加,Notch信号通路相关蛋白Notch1、NICD、Hes-1和c-Myc的表达逐渐下降。同样,免疫荧光结果显示随3,6-DHF浓度的增加,MDA-MB-231细胞中Notch1和Hes-1的表达逐渐降低。免疫共沉淀实验(co-immunoprecipitation,CO-IP)和WB结果显示,当IP蛋白分别为CSL和MAML时,随3,6-DHF浓度升高,NICD表达逐渐降低。WB结果显示3,6-DHF(20mg/kg)组移植瘤中Notch通路相关蛋白Notch1和NICD表达明显低于对照组移植瘤。同样,免疫组化实验结果显示3,6-DHF(20mg/kg)处理组移植瘤中Notch1、NICD和Hes-1的表达低于对照组。(2)MDA-MB-231细胞转染pc DNA3.1-Notch1质粒(TCNotch1)或转染anti-mi R-34a寡核苷酸(TCanti-34a),WB结果显示20μM 3,6-DHF作用TCNotch1和TCanti-34a细胞不能降低Notch1和NICD的蛋白表达水平。在TCNotch1和TCanti-34a细胞中,Notch1过表达可降低3,6-DHF对EMT标志蛋白Snail、Twist和Slug的抑制效应,减弱3,6-DHF对E-cadherin蛋白的上调作用。同样,mi R-34a沉默也可以减轻3,6-DHF对Snail、Twist和Slug蛋白的下调作用,降低3,6-DHF对E-cadherin蛋白的上调作用。Transwell侵袭和迁移实验结果显示3,6-DHF作用于TCNotch1和TCanti-34a细胞降低两种细胞穿过小室的数量,但是仍明显高于UTC细胞。ALDEFLOUR○R分析结果显示3,6-DHF可抑制UTC细胞中ALDH+细胞的比例,3,6-DHF处理也可降低TCNotch1和TCanti-34a细胞中ALDH+细胞的比例,但仍高于UTC细胞中ALDH+细胞的比例。微球体成球实验结果显示3,6-DHF降低UTC细胞、TCNotch1和TCanti-34a细胞中微球体的数量,但TCNotch1和TCanti-34a细胞成球数量仍明显高于UTC细胞。主要结论:(1)3,6-DHF可在体内外对乳腺癌细胞EMT的发生和BCSCs的形成具有显著的抑制效应。(2)3,6-DHF可从体内外显著抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移能力。(3)3,6-DHF能显著抑制Notch信号通路相关蛋白的表达及NICD-CSL-MAML转录复合体的结合,进而抑制Notch信号通路;而采用质粒转染过表达Notch基因或si RNA沉默mi R-34a表达后,3,6-DHF对乳腺癌细胞EMT的抑制效应被显著抑制。表明Notch信号通路在3,6-DHF抑制乳腺癌细胞发生EMT中发挥了重要的作用。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.9

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