负载表阿霉素的聚乙二醇—聚谷氨酸胶束在肝癌治疗中的应用
本文选题：表阿霉素 切入点：两亲性嵌段共聚物 出处：《吉林大学》2015年博士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在肿瘤导致的死亡原因中占第3位,对经济发展及相关人群的生活质量造成了极大的负面影响。肝切除是肝癌治疗的首选方案,能够有效的提高患者的生活质量及延长生存期。但是由于其起病隐匿、发展迅速,绝大多数肝癌患者诊断时已处于疾病的中晚期,而失去了接受手术治疗的机会。作为另外一种可能治愈肝癌的手段,肝移植由于肝源匮乏、费用较高等原因很难惠及多数患者。化疗在肿瘤的治疗中有着重要的地位,但传统化疗药物具有组织分布特异性差、循环半衰期短等缺陷,使其难以在肿瘤部位保持有效的药物浓度,加之多数肝癌对细胞毒性药物不敏感,从而导致难以达到理想的治疗效果。另外,难以耐受的毒副作用也是限制传统化疗药物应用的重要原因。纳米载药系统在临床领域的应用为克服传统化疗药物的缺陷及提高化疗疗效提供了新的方向。尤其是生物相容性良好且可修饰性强的聚合物纳米载体,可实现药物的靶向输送及智能释放,有望显著改善传统化疗药物的药代动力学特性并延长其循环半衰期。以聚氨基酸为基础的两亲性共聚物更是以其可控的生物可降解性及巧妙的二级结构,成为聚合物纳米载体构建的理想选择。本研究以传统的肝癌化疗药表阿霉素(EPI)及合成的聚乙二醇-block-聚(L-谷氨酸)(m PEG-b-PGA)为基础,成功构建了载EPI纳米胶束,并通过体内外的各种实验手段证实其在肝癌治疗的优势。具体实验内容如下。第一部分:p H敏感的负载EPI的聚乙二醇-block-聚谷氨酸(m PEG-b-PGA/EPI)胶束的制备、表征及细胞内药物传输。本研究(1)首先以端氨基聚乙二醚单甲醚作为大分子引发剂,引发L-谷氨酸苄酯-N-羧酸酐发生开环聚合反应,并对所获取的产物进行脱苄酯保护最终得到了两亲性的m PEG-b-PGA。应用核磁共振氢(1H NMR)谱和傅里叶变换红外色谱(FT-IR)对上述材料的化学结构进行表征,结果显示我们成功合成了该共聚物。然后应用透析法,利用m PEG-b-PGA共聚物与EPI间的静电相互作用,合成了载EPI的聚合物胶束m PEG-b-PGA/EPI,动态激光光散射(DLS)及透射电子显微镜(TEM)检测结果显示该胶束呈现为大小在80-90nm左右的规则球形,符合实体肿瘤渗透与滞留增强(EPR)效应对纳米颗粒的粒径要求。经测定m PEG-b-PGA/EPI的载药率及载药效率分别为14.68 wt.%和72.50 wt.%,说明以聚氨基酸为基础的两亲性共聚物胶束能够高效的负载疏水性的传统化疗药物。后续进行的体外释放实验证实m PEG-b-PGA/EPI具有良好的缓释及p H敏感的智能释放功能。(2)应用激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测m PEG-b-PGA/EPI的Hep G2肝癌细胞的摄取情况,结果显示载药胶束能够有效的进入细胞,并且随着时间的延长,其在细胞内的积累量逐渐接近游离EPI。应用MTT实验检测材料及m PEG-b-PGA/EPI的对肝癌细胞Hep G2毒性,结果显示m PEG-b-PGA材料具有良好的组织相容性,即使在100μg/m L的高浓度条件下作用72 h,细胞仍保持了90%以上的活性,而m PEG-b-PGA/EPI则表现出了典型的时间及浓度依赖性的肝癌细胞活性抑制作用。第二部分:m PEG-b-PGA/EPI的毒理分析及组织分布。为了评估本研究中合成的载药纳米胶束的体内组织相容性表现及对游离EPI的药代动力学特征改善作用,我们进行了组织相容性溶血实验、最大耐受量(MTD)实验及体内药物分布检测。m PEG-b-PGA/EPI最终将通过静脉注射的方式给药,因此良好的血液相容性是其进一步应用的重要基础。在本研究的溶血实验中,大剂量的m PEG-b-PGA(5 mg/m L)也未引起明显的溶血反应。而且m PEG-b-PGA包装能够降低高浓度游离EPI的溶血危险性。进一步的MTD实验证实m PEG-b-PGA的包载对游离EPI的机体毒性具有良好的改善作用,能有效的提高药物的应用剂量。应用小鼠皮下肝癌模型进行的体内药物组织分布实验结果显示,与游离EPI相比,m PEG-b-PGA/EPI具有显著增强的肿瘤内药物蓄积作用,可能提示其会产生更佳的抗肝癌疗效。第三部分:m PEG-b-PGA/EPI的体内抗肝癌疗效及安全性研究。提高传统化疗药物的抗肿瘤疗效并降低其副作用是纳米药物载体设计的最终目的。本研究选取了小鼠肝癌细胞H22作为瘤源,构建了BALB/c小鼠肝癌皮下模型,作为m PEG-b-PGA/EPI对EPI抗肿瘤疗效影响的评价工具。分别应用8 mg/kg的EPI、相当药物剂量的m PEG-b-PGA/EPI及相应m PEG-b-PGA/EPI组内材料剂量的m PEG-b-PGA对肝癌小鼠模型进行静脉给药治疗,并以生理盐水注射作为阴性对照。给药每隔3天重复一次,在为期16天的治疗过程中每天定时测量肿瘤体积及小鼠体重的变化。治疗结束后,处死小鼠并分离肿瘤组织及心、肝、脾、肺和肾等重要脏器并称重,进一步应用苏木精与伊红(HE)染色、原位凋亡检测及免疫荧光检测等手段评估不同治疗手段引起的脏器损伤、肿瘤组织坏死和凋亡情况。在抗肝癌疗效方面,虽然两种药物治疗均显示出了抑制肿瘤生长的作用,但借助自身的缓释、p H敏感的智能释放特性及实体肿瘤的EPR效应,与游离EPI组相比,m PEG-b-PGA/EPI治疗显示出了显著增强的疗效,m PEG-b-PGA/EPI组的肿瘤抑制率、肿瘤指数均显著优于EPI组。HE染色及原位凋亡检测结果进一步明确了上述优势,肝癌坏死面积及凋亡细胞平均荧光强度统计数据显示m PEG-b-PGA/EPI能够显著增强EPI引起的肿瘤细胞坏死及凋亡程度。同时,本研究应用免疫荧光技术检测了各治疗组肿瘤组织裂解的Caspase-3及Ki-67的表达情况,上述两种蛋白在m PEG-b-PGA/EPI组及EPI组的平均荧光强度分别为2.60±0.49%、0.67±0.19%和1.75±0.41%、0.40±0.13%,差异具有统计学意义(P0.05),该结果从另外一个侧面反映了m PEG-b-PGA/EPI对EPI诱导肿瘤细胞凋亡及抑制增殖的增强作用。安全性方面,m PEG-b-PGA材料的反复应用未引起模型小鼠体重、脏器指数及脏器病理学检测相对于对照组的明显改变,再次证明了m PEG-b-PGA良好的组织相容性及作为药物载体的可行性。虽然两种剂型的药物均引起了不同程度的模型小鼠体重的降低及脏器的损伤,但m PEG-b-PGA/EPI的伤害程度更低。更有意义的是,m PEG-b-PGA/EPI显著改善了EPI组模型小鼠肝脏及脾脏指数降低的情况。综上所述,在生物相容性良好的m PEG-b-PGA聚合物基础上,本研究合成的载EPI胶束m PEG-b-PGA/EPI能够显著增强EPI的肝癌治疗效果并降低其副作用,具有优异的医学应用前景。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
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，本文编号：1620552
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