肾上腺髓质素在胃癌中调控机制的研究

发布时间：2018-03-28 16:56

本文选题：AM　切入点：siRNA　出处：《江苏大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:肾上腺髓质素(adrenomedullin,AM)是日本学者首先在人手术切除的嗜铬细胞瘤组织中分离出的一种多肽,其在正常人的血浆中以一定浓度存在,广泛参与了血管的扩张和肺的扩张,对于血压的调控、多种激素的调节有作用。近年越来越多的文献报道AM在多种肿瘤组织中高表达,对肿瘤的发生发展有调控作用。本研究验证AM及其受体在胃癌组织中的表达情况,分析AM表达量与临床病理之间的关系;进行系列体外实验探索AM对胃癌细胞功能学方面的影响,试图找出AM调控胃癌发生发展的作用机制。希望该研究为临床分子诊断胃癌及胃癌的靶向治疗提供新的依据和思路。方法:利用免疫组方法检测临床胃癌标本中的差异表达,并分析AM差异表达与临床病理之间的关系;运用IHC检测AM及其受体CRLR、RAMP1、RAMP2、RAMP3的表达情况;运用RNAi稳定的敲低BGC细胞AM的表达量,并观察其对胃癌细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡的影响,并试图找出AM作用的信号通路;运用分子生物学技术构建稳定的敲低和过表达AM的载体,观察对胃癌细胞BGC-823自噬的影响。具体操作方法如下:1收集胃癌组织及其配对的癌旁组织,q RT-PCR分析AM基因的表达水平,IHC检测AM的表达量,分析表达量与临床病理之间的关系。分析AM在胃癌组织及癌旁组织的表达差异。运用IHC检测临床胃癌标本中AM的受体CRLR、RAMP1、RAMP2、RAMP3的表达情况。2选取分化程度不同的胃癌细胞株:BGC-823,MGC,SGC-790,HGC和MKN-45检测AM表达水平。构建绝对定量载体检测AM-m RNA水平表达情况。筛选出AM表达量最高的一株细胞。3设计并筛选针对AM的小干扰RNA,通过脂质体转染到胃癌BGC-823细胞中,Westerning Blot验证AM蛋白被成功的敲低后,进行平板克隆形成实验,以验证对胃癌细胞增殖的影响;进行细胞划痕实验,以验证对胃癌细胞迁移的影响;进行Transwell小室实验,以验证对胃癌细胞侵袭的影响;进行Annexin V-FITC\PI细胞凋亡检测实验,以验证对胃癌细胞凋亡的影响。4验证JNK、P-JNK、AKT、P-AKT、PKA、P-PKA等相关的通路蛋白,验证BCL2、BAX、caspase3、cleaved-caspase3凋亡相关的通路蛋白,试图找出AM发挥作用的信号通路。5构建GFP-LC3A/B载体,Lipofectamine2000转染细胞,同时分别转染特异性针对AM的小干扰RNA序列和pc DNA-AM过表达载体,设置阴性对照组和空白对照组。Western-blot分析自噬相关的蛋白LC3A/B和Beclin。共聚焦显微镜下观察自噬小体的形成。结果:相对于癌旁组织,胃癌标本中AM的蛋白表达量和基因表达量显著上升。表达量升高的临床患者生存率明显低于表达量不高的患者(Pvalue=0.0258)。AM及其受体CRLR、RAMP1、RAMP2、RAMP3在胃癌中的表达量比起临近的癌旁组织均有不同程度的升高,按照免疫组化评价标准平均得分分别为9分、8分、6分、8分、8分。在胃癌患者中高表达的AM有更高的临床分级(Pvalue=0.011)、更大的肿瘤体积(Pvalue=0.008)。转染AM-si RNA稳定的敲低AM后,流式细胞术检测BGC-823细胞的凋亡率呈降低趋势,划痕实验检测BGC-823细胞的迁移能力下降,平板克隆增殖实验检测细胞的增殖能力降低。AM在稳定敲低之后,BCL2表达量降低,BAX表达量升高,caspase3表达量未见明显变化,cleaved-caspase3表达量升高。验证JNK、P-JNK、AKT、P-AKT、PKA、P-PKA相关通路蛋白,P-AKT蛋白明显降低。当AM蛋白被稳定的敲低和过表达后,共聚焦显微镜显示自噬小体没有显著改变。自噬相关蛋白,LC3A/B和Beclin没有显著改变。结论:AM及其受体CRLR、RAMP1、RAMP2、RAMP3在胃癌中是高表达的比临近的癌旁组织,这一比例占到65%左右。同时生存分析显示AM的表达量与生存时间成负相关。同时AM的表达量与肿瘤细胞的大小、肿瘤的分级和恶性程度的分级相关。当AM被稳定的敲低之后,体外培养的胃癌细胞BGC-823增殖速度减慢、细胞迁移速率降低、细胞凋亡增加、细胞侵袭力减弱。这提示我们靶向敲低AM的表达后,可以抑制癌细胞的增殖和迁移速度,增加其凋亡率,进而降低胃癌的延进,增加胃癌患者生存时间。而调控机制的研究发现,AM发挥其对细胞增殖迁移侵袭的影响最大可能是通过AKT信号通路。AM对胃癌细胞凋亡影响可能是激活第三条内质网凋亡途径,最终激活下游的凋亡执行分子Caspase-3实现凋亡。本研究并没有发现AM对于胃癌肿瘤细胞自噬的影响。肿瘤细胞基础水平自噬率太低,共聚焦显微镜没有检测到明显的自噬小体的改变。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of AM on gastric cancer cell proliferation , invasion , migration and apoptosis . The results showed that there was no significant change in the expression of AM and the expression of caspase - 3 in gastric cancer . AM and its receptors CRLR , RAMP1 , RAMP2 , RAMP3 are highly expressed in gastric cancer than adjacent adjacent tissues , which accounts for about 65 % .

【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2

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