芹菜素抗非小细胞肺癌作用及协同增敏顺铂抗肺癌作用机制初步研究

发布时间：2018-04-01 13:23

本文选题：芹菜素　切入点：非小细胞肺癌　出处：《广东药科大学》2017年硕士论文

【摘要】：首先,采用MTT法研究了芹菜素、顺铂单独和联用对六种人非小细胞肺癌细胞株(A549、SPC-A-1、H1299、H1650、LTEP-a2、H460)的增殖抑制作用,结果表明,芹菜素对于A549、H460、H1650、H1299、SPC-A-1、LTEP-a2细胞作用不同时间(24 h、48 h、72 h),其IC50分别是55.17、34.58、26.41μM,47.37、33.28、23.94μM,67.72、34.11、22.87μM,130.98、50.07、34.36μM,125.25、55.11、28.00μM,60.26、37.19、20.85μM,说明其具有较好的抗非小细胞肺癌细胞增殖的作用,且呈一定的剂量和时间依赖性;与顺铂单独作用肺癌细胞相比,芹菜素与顺铂联用具有很好的协同增敏效果。其次,采用细胞计数法、平板克隆形成实验、Hoechst 33258染色、流式细胞术等方法分别检测芹菜素作用后非小细胞肺癌细胞株H460细胞增殖、凋亡和周期分布等的变化。细胞计数结果表明,用不同浓度(0、20、40、80μM)的芹菜素孵育肺癌细胞H460不同时间(24、48、72 h)后,细胞增殖抑制作用与作用剂量和作用时间呈正相关;同样,体外细胞克隆形成实验结果显示细胞集落形成数与作用剂量呈负相关。荧光染色结果显示,与阴性对照组(Control)相比,不同浓度的芹菜素(20、40、80μM)分别作用H460细胞株不同时间(6 h和12 h)后,明场下观察细胞会出现不同程度的细胞凋亡形态学变化,如出现皱缩的细胞核,边缘不清晰的细胞膜,甚至出现破碎的细胞核。在倒置荧光显微镜紫外波段的激发光下观察,肿瘤细胞染成蓝色,活细胞染色较浅,死细胞染色较深。随着芹菜素作用浓度增加和作用时间的延长,H460细胞染色逐渐加深,细胞数量逐渐减少,凋亡小体数量增加。AnnexinV-FITC/PI双染法检测芹菜素作用H460细胞凋亡率的影响,可发现H460细胞随着芹菜素作用浓度和作用时间增加而出现更多的凋亡细胞。细胞周期检测结果表明,H460细胞大部分处于G0/G1期。与Control组相比,随着芹菜素的浓度增加,细胞在G2/M期的数量增加,和芹菜素的剂量和时间呈一定的依赖性,说明芹菜素能通过阻滞细胞周期进程,从而影响H460细胞的增殖。最后,初步探究芹菜素协同增敏顺铂抗非小细胞肺癌的作用机制。采用western blot和qRT-PCR实验方法检测不同浓度(0、20、40、80μM)的芹菜素孵育H460细胞株24 h,从蛋白和mRNA表达水平变化等方面检测Nrf2、ARE抗氧化反应的元件(NQO1、HO-1、GSTA1)表达的变化(相对于骨架蛋白β-actin、骨架基因GAPDH)。此外,选取叔丁基对苯二酚(tert-butyl hydroquinone,t-BHQ)作为Nrf2的激动剂,增加t-BHQ 50μM,芹菜素40μM+t-BHQ 50μM两组作用H460细胞株24 h。结果表明,芹菜素能下调H460细胞中Nrf2、NQO1、HO-1、GSTA1蛋白和mRNA的表达,且与作用剂量呈正相关。与Control组相比,t-BHQ 50μM组的Nrf2蛋白和mRNA表达上调,且差异有显著性(p0.05),其他的蛋白上调作用不明显,没有显著性差异,但是诱导了mRNA的表达。与t-BHQ 50μM组相比,芹菜素40μM+t-BHQ 50μM组的Nrf2的蛋白和基因表达明显下调。与芹菜素40μM组相比,芹菜素40μM+t-BHQ 50μM组Nrf2的蛋白和基因表达有些上调,说明t-BHQ能逆转芹菜素抑制Nrf2表达的作用。但是Nrf2下游的分子可能受多个核因子调控,故表现出不太一致或者趋势不明显的结果。以上结果说明芹菜素具有下调Nrf2表达的作用,其可能与芹菜素协同增敏顺铂抗非小细胞肺癌作用有关。综上所述,芹菜素具有抗肺癌细胞增殖的作用,并能阻滞细胞周期进程,诱导细胞凋亡。小剂量的芹菜素还具有协同增敏顺铂抗肺癌作用,其可能与抑制Nrf2-ARE信号通路有关。本论文旨在研究芹菜素与顺铂化疗药物联用协同增强药物治疗效果,为肺癌的联合治疗提供新的方法。
[Abstract]:The effects of apigenin and cisplatin on proliferation , apoptosis and cycle distribution of human non - small cell lung cancer cell lines A549 , SPC - A - 1 , 1299 , H1650 , LTE2 , H460 were studied by MTT assay . H460 cells were mostly in G0 / G1 phase . As the concentration of apigenin increased , the number of cells in G2 / M phase increased , and the dose and time of apigenin increased , suggesting that apigenin could inhibit the proliferation of H460 cells by blocking cell cycle progression . Compared with control group , the expression of Nrf2 , NQO1 , HO - 1 , GSTA1 protein and mRNA in 50 渭M of apigenin decreased significantly . The results showed that apigenin could decrease the expression of Nrf2 , NQO1 , HO - 1 , GSTA1 and Nrf2 in the 50 渭M group .

【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

【参考文献】