STGC3基因低表达对NP69细胞的影响及机制研究

发布时间：2018-04-01 14:38

  本文选题：鼻咽癌　切入点：STGC3　出处：《南华大学》2015年博士论文

【摘要】：[目的]本研究运用sh RNA技术,敲低永生化人鼻咽黏膜上皮NP69细胞中STGC3基因的表达,构建STGC3稳定低表达NP69细胞,分析STGC3基因表达降低对其生长、增殖、侵袭、迁移及裸鼠成瘤能力等生物学行为的影响;应用蛋白质组学技术,分析STGC3基因低表达对NP69细胞蛋白质表达谱的影响,筛选与鉴定差异表达蛋白质分子,实验验证与分析差异表达蛋白质分子的功能,明确STGC3基因在鼻咽黏膜上皮细胞恶性转化过程可能发挥的作用及其分子机制,为全面揭示STGC3基因的功能提供实验依据。[方法]根据碱基序列设计靶向干扰STGC3基因的sh RNA,构建真核表达干扰载体,应用脂质体2000将重组质粒及对照质粒分别转染NP69细胞,经不同浓度G418筛选,建立STGC3稳定低表达的NP69细胞系,运用MTT法、流式细胞术及细胞集落形成实验,分析观察其生长、增殖及细胞周期的变化;同时分别采用Transwell小室及裸鼠成瘤实验,分析探究其迁移、侵袭能力及裸鼠成瘤能力的变化;再运用蛋白质组学技术筛选、鉴定其差异表达蛋白质分子,分析其生物学功能;并运用IPA(Ingenuity Pathways Analysis)分析差异蛋白质分子之间的相互作用。随后运用RT-PCR、Western-Blotting验证部分差异蛋白质分子的表达,并检测其在鼻咽癌细胞及鼻咽癌组织中的表达;在此基础上进一步干预差异表达蛋白质分子的功能,研究其对STGC3基因低表达NP69细胞系及鼻咽癌细胞生长、增殖、侵袭与迁移能力的影响,同时检测其相关信号通路蛋白质分子的表达。[结果]经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,确定成功构建了STGC3真核表达干扰载体并命名为p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3。将其与对照质粒p RNAi-U6.1/scramble分别转染NP69细胞并经400μg/ml G418筛选后,荧光显微镜下能见到转染细胞内的绿色荧光,RT-PCR检测结果显示,p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3干扰载体转染NP69细胞后,STGC3 m RNA水平显著低于对照组,表明该干扰载体能成功敲低NP69细胞中STGC3基因的表达,稳定低表达STGC3的NP69细胞(p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69细胞)建立成功。细胞生长曲线及细胞集落形成实验结果显示,从第4天开始,p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69细胞生长增殖速度明显快于对照组;其所形成的细胞集落数目明显多于对照组,集落体积也大于对照组(p0.05),表明STGC3基因低表达后能促进NP69细胞生长增殖,增强其克隆形成能力。FCM分析结果表明,p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69细胞处于(G2+S)期比例明显高于对照组(p0.05),表明STGC3基因低表达后能影响细胞周期进程,提高细胞增殖速度及克隆形成能力。Transwell小室实验结果显示,未包被Matrigel时,p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69细胞其迁移细胞数(320.42±28.54)明显多于p RNAi-U6.1/scramble/NP69细胞(206.26±15.40)及未转染的NP69细胞(180.72±16.03);包被Matrigel时,p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69细胞其迁移细胞数(116.33±3.55)也明显多于对照组[分别为(43.00±2.00)、(40.67±2.52)],差异均有显著性意义(p0.05),表明STGC3基因低表达后能增强NP69细胞的迁移、侵袭能力;将p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69细胞及对照组细胞分别接种于裸鼠皮下,经8周饲养并观察,但均未见肿瘤的形成。i TRAQ同位素标记及质谱技术分析结果显示,与对照组比较,p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69细胞中蛋白质表达谱发生改变,共鉴定出表达差异明显的蛋白质分子83种,其中表达上调的蛋白质有45种,包括m TOR、TPM2、Cofilin-1、ANXA3、Musashi-2、Kindlin-2等;表达下调的蛋白质有38种,包括Beclin-1、TSC-22、AMOTL2等,这些差异蛋白主要参与调控细胞生长增殖、蛋白质合成、物质代谢、细胞骨架、信号传导及自噬等细胞生命活动过程。IPA蛋白质相互作用分析软件表明,这些差异表达蛋白之间形成复杂的相互作用网络,影响p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69细胞的功能。经过RT-PCR、Western-Blotting及免疫组化等检测发现,与对照组比较,p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69细胞中m TOR表达增强、Beclin-1表达降低,证实了蛋白质组学检测结果的准确性和可信性;同时检测发现在CNE1、CNE2鼻咽癌细胞及鼻咽癌组织中也存在m TOR表达增强、Beclin-1表达降低,且鼻咽癌组织中m TOR蛋白的表达与Beclin-1蛋白表达呈负相关;临床Ⅲ、Ⅳ期患者及有淋巴结转移的鼻咽癌组织中m TOR蛋白阳性表达率分别高于临床Ⅱ期患者及无淋巴结转移者,差异具有显著性意义(p0.05)。应用不同浓度(0、1、2、4、8μmol/L)的雷帕霉素处理p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69、CNE1、CNE2细胞后,雷帕霉素能显著抑制p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69、CNE2细胞的生长增殖,且变化呈浓度依赖性,而不同浓度雷帕霉素作用不同时间后均对CNE1细胞无明显抑制作用。同一浓度雷帕霉素处理24h后,对p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69、CNE2细胞的抑制率低于处理48h和72h的抑制率,差异有统计学意义(P0.05),而处理48h和72h的抑制率之间差异无统计学意义。8μmol/L雷帕霉素处理48h后,p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69、CNE2细胞迁移、侵袭能力均明显降低,差异有统计学意义(P0.05),但雷帕霉素对CNE1细胞迁移、侵袭能力无明显影响。Western blot检测结果显示,雷帕霉素处理48h后,p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69细胞、CNE2细胞中P-p70S6K和cyclin D1的表达降低,但m TOR、p70S6K蛋白的表达无明显变化;而8μmol/L雷帕霉素处理48h后,CNE1细胞中m TOR、p70S6K、P-p70S6K和cyclin D1的表达较处理前均无明显变化;这些结果表明雷帕霉素能抑制p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69和CNE2细胞生长增殖及迁移、侵袭能力,可能与抑制其P-p70S6K和cyclin D1的表达有关。[结论]1)STGC3表达降低可导致NP69细胞呈现出部分恶性表型,同时伴随m TOR、Beclin-1等83种蛋白质表达发生改变。2)STGC3低表达导致NP69细胞呈现部分恶性特征,其机制可能与m TOR信号通路密切相关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.63

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本文编号：1696034