胃癌微环境差异蛋白质筛选及表达机制

发布时间：2018-04-01 15:11

本文选题：胃癌　切入点：肿瘤微环境　出处：《南华大学》2016年博士论文

【摘要】：目的:胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。本研究旨在寻找胃癌微环境中差异蛋白质分子,并探讨其表达调控的机制,揭示微环境在胃癌发生发展过程中的作用。方法:1.采用激光捕获显微切割(LCM)技术,分别切取新鲜正常胃粘膜组织(NGM)和胃腺癌组织(GAC)中间质,获取高纯度的NGM和GAC间质总蛋白质,同位素标记(i TRAQ),结合二维液相色谱联用质谱(2D LC-MS/MS)技术,鉴定NGM和GAC间微环境中的差异表达蛋白质分子。通过生物信息学方法,分析胃癌微环境蛋白质分子间的相互作用。选取胃癌间质中高表达蛋白质(FN1和MCL1)和低表达蛋白质(EMILIN1和COL1A1),运用Western blot和免疫组织化学染色方法,验证NGM及GAC组织中蛋白质组学实验结果,分析GAC间质差异表达蛋白质分子的临床病理学意义。2.蛋白质组学实验结果,经生物信息软件分析,筛寻调控GAC间质差异蛋白质分子表达的miRNAs。选取其中的miR-125b进行研究,采用q RT-PCR和原位杂交技术,检测miR-125b在NGM和GAC组织中的表达,分析miR-125b表达与胃癌患者临床病理及预后的关系;将miR-125b转染于胃癌MGC-803细胞,通过细胞生长曲线绘制、Transwell侵袭、流式细胞仪、Western blot及裸鼠成瘤,分析miR-125b导入MGC-803细胞,对MGC-803细胞生长增殖、凋亡及侵袭的影响。Targetscan 6.2软件分析,预测miR-125b可能参与调控胃癌的靶基因;采用荧光素酶基因报告检测、q RT-PCR与Western blot方法,证实MCL1基因为miR-125b调控的靶基因;免疫组织化学染色,观察注射miR-125b,荷瘤组织中MCL1表达水平;构建MCL1干扰载体,采用生长曲线绘制、Transwell侵袭实验、流式细胞仪与Western blot,观察敲低MCL1基因表达,对MGC-803细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。结果:1.本研究在胃癌间质中总共鉴定出差异蛋白质分子123个,其中表达上调56个,下调67个,这些蛋白质涉及肿瘤相关的信号通路(如MAPK信号通路、VEF信号通路、p53信号通路等)、器官发育、细胞生长、增殖、凋亡、代谢、激应、运输及免疫等;部分蛋白质在STRING网络中呈现相互节点,两两间相互联系;免疫组织化学染色结果显示,EMILIN1和COL1A1蛋白质在胃癌组织中低表达,而MCL1和FN1蛋白质则在胃癌组织中高表达。MCL1和FN1在胃癌中高表达,与胃癌分化程度、肿块大小、淋巴结转移及TNM分期呈正相关,与EMILIN1和COL1A1表达则呈负相关(P0.01)。2.通过生物信息学软件,预测调控胃癌微环境差异蛋白质分子的mic RNAs,分析显示miR-125b调控多个蛋白质;miR-125b在胃癌组织中低表达,其表达与胃癌组织的分化程度呈正相关(P0.01);miR-125b在TNM分期I-II期患者的阳性表达率高于III-IV期患者,与胃癌患者TNM分期呈负相关(P0.01);miR-125b表达与胃癌淋巴结转移呈负相关(P0.01);Kaplan-meier生存曲线分析显示,miR-125b表达胃癌患者生存期相关,miR-125b高表达患者生存期长于miR-125b低表达组,miR-125b表达低,患者预后差(P0.01)。3.miR-125b导入MGC-803细胞,细胞生长速度减慢,侵袭能力降低,细胞凋亡率增加,Cleaved caspase-3及Cleaved PARP表达增加(P0.01),裸鼠荷瘤体积变小、重量减轻(P0.01);MCL1是miR-125b的靶基因,核苷酸结合位点是MCL1基因3’UTR的2613-2620;miR-125b高表达,MGC-803细胞MCL1基因表达降低(P0.01);敲低MCL1基因在MGC-803细胞的表达,细胞生长速度减慢,侵袭能力降低,细胞凋亡增加,Cleaved caspase-3及Cleaved PARP表达增加(P0.01);注射miR-125b,可抑制裸鼠荷瘤生长,荷瘤组织内MCL1蛋白质的表达降低(P0.01)。结论:1.筛选胃癌微环境差异表达蛋白质123个,其中上调56个,下调67个。2.miR-125b在胃癌组织中低表达,其表达水平与胃癌分化程度、TNM分期、淋巴结转移及患者预后相关。3.miR-125b可抑制MCL1基因表达,活化Caspase-3信号通路,降低MGC803细胞增殖与侵袭能力。
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【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2

【参考文献】