过滤装置与腺病毒相结合捕获活的循环肿瘤细胞的研究

发布时间：2018-04-02 02:05

  本文选题：循环肿瘤细胞　切入点：端粒酶表达　出处：《西北农林科技大学》2015年博士论文

【摘要】：肿瘤是危害人类健康的严重疾病之一,虽然目前对于肿瘤的的治疗已经取得一定的进展,但仍然有绝大多数肿瘤发展成为恶性肿瘤。由于缺乏有效的治疗手段,一旦恶性肿瘤转移,患者一般预后不良,生存率极低。因此,对肿瘤进行有效地早期检测将有助于降低恶性肿瘤的发生,从而提高患者生存率。血液中循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)的检测被认为是一种非常有效的肿瘤的早期诊断方法,对后期诊断和治疗具有重要意义。然而由于循环肿瘤细胞在血液中极为稀少(通常只有1个CTC/105 107白细胞),现有的CTCs检测及分离方法存在着专一性差,灵敏度低,检测时间长等缺陷而未能被广泛开发利用。本文依据人端粒酶逆转录酶h TERT(Human Telomerase Reverse Transcriptase)在肿瘤细胞中高表达而在正常体细胞中低表达的特性,以h TERT作为启动子构建腺病毒,并结合一种快速过滤白细胞的新装置FMSA(Flexible Micro Spring Array),从而对循环肿瘤细胞进行捕获并感染,探索得到一种可以高效快速的捕获活的循环肿瘤细胞的方法,并通过少量患者及非患者血液样本初步验证本研究所得方法的可行性,为后期运用于临床检测奠定了基础。现将本研究所得结果罗列如下:(1)构建了四种重组腺病毒质粒。用GFP标签替换pAdZ5的E3区,构建对照组质粒pAd5G,其它三种质粒分别在pAd5G的E1a的上游区域加入人端粒酶逆转录酶hTERT的某些片段作为启动子,其中pAd5GTS包含一段450-bp hTERT的启动子,其可以在含有hTERT的细胞中表达,pAd5GTL,包含一段1.4-kb hTERT启动子,加入了hTERT在正常细胞中表达的抑制元件,pAd5GTSe启动子部分除了和一段450-bp hTERT的启动子(和pAd5GTS相同)外,还添加了三个20bp的hTERT元件,该元件可以增强hTERT在肿瘤细胞中的表达而抑制其在人体正常细胞中的表达。这四种腺病毒通过HEK-293细胞包装得到,并通过荧光观察证明其可表达性。(2)本研究通过q RT-PCR和Microplate Reader检测各细胞中hTERT表达量和GFP信号的关系,结果表明所有的重组腺病毒都可以在端粒酶高表达的细胞中更高效的复制,而对端粒酶低表达的细胞则侵染率很低,即可以用GFP荧光蛋白是否表达来区分肿瘤细胞与人体正常体细胞(因为端粒酶在约85%以上的肿瘤细胞中高表达,而在人体正常体细胞中则表达很低或者不表达)。(3)筛选最佳腺病毒及其侵染的最佳浓度。通过不同浓度的腺病毒感染各种mCherry标记的肿瘤细胞,人体正常细胞,白细胞,确定最佳感染浓度为107PFU/ml,其后用重组腺病毒侵染(侵染浓度为107PFU/ml)肿瘤细胞/人体正常细胞与白细胞混合物,选出最佳腺病毒--Ad5GTSe,因为其可以感染较少白细胞的同时感染较多的肿瘤细胞,而感染的白细胞越少,检测造成的假阳性信号就越低,该研究所用肿瘤细胞/人体正常细胞为荧光蛋白mCherry标记的细胞,使其易于和白细胞分辨,从而提高研究准确度。(4)初步检验本文所得检测方法的可行性。将FMSA过滤装置与选择性腺病毒相结合运用于少量患者新鲜血液样本检测,初步验证本研究所得检测循环肿瘤细胞CTCs方法的有效性。首先,我们检测了FMSA过滤装置的可行性,通过将mCherry标记的肿瘤细胞人为加入到正常人血液中,经由FMSA过滤装置后,85%以上的肿瘤细胞及少量白细胞(约为103~5个)被捕获在滤膜上,利用最佳腺病毒Ad5GTSe感染滤膜上的细胞,24小时后荧光显微镜下观察,数据显示该方法同体外单独感染肿瘤细胞与白细胞混合物的感染率一致,证明该装置可行。研究进一步将该检测方法运用于少量已知肿瘤类型的患者血液样本,并与CellSearch对比,结果初步证明这种将二者结合的方法对于检测新鲜血液样本中的循环肿瘤细胞可行。以上结果表明,本研究探索到一种高效快捷的捕获及检测血液中活的循环肿瘤细胞的方法:即将FMSA过滤装置与带有h TERT启动子的选择性腺病毒相结合。经患者新鲜血液样本的初步实验表明,该方法操作简单,对循环肿瘤细胞的识别专一性强,为后期恶性肿瘤的早期诊断提供了一种初步检测方法。但对于临床检测的准确性,仍然需要进一步加大血液样本进行验证。
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本文编号：1698280