LncRNA AK 036396对粒细胞样髓源抑制性细胞免疫抑制功能的调控机制及其在抗瘤免疫中的作用

发布时间：2018-04-15 13:00

  本文选题：LncRNAAK036396 + Fcnb　； 参考：《江苏大学》2017年博士论文

【摘要】：目的:恶性肿瘤目前已经成为人类死亡的主要疾病,尽管针对肿瘤的靶向治疗发展迅速,但是总体治疗效果仍然不够理想。大量临床研究表明,肿瘤的免疫逃逸是造成肿瘤治疗失败的主要因素。本研究中,我们通过探索长链非编码RNA(Long noncoding RNA,LncRNA ) AK036396对粒细胞样髓源性抑制细胞(Granulocytic myeloid-derived suppressor cells,G-MDSCs)发育及功能的调控,寻找肿瘤免疫治疗的新靶点。方法:1.采用Arraystar LncRNA表达谱芯片技术检测在野生型小鼠脾脏来源CDllb+Ly6G+细胞与荷瘤小鼠肿瘤来源G-MDSCs中表达的lncRNA,筛选出表达呈现明显差异的lncRNA,并利用实时荧光定量定量PCR(realtimefluorescene quantitative PCR, qRT-PCR)进行进一步的确认;利用 qRT-PCR 分析 lncRNA AK036396在不同髓系细胞以及不同发育阶段G-MDSCs中的表达。2.分析Arraystar LncRNA表达谱芯片,筛选出lncRNA可能调控的靶分子,并使用qRT-PCR进行进一步验证。利用qRT-PCR与Western-blot检测在不同髓系细胞中靶分子Fcnb的表达情况。利用特异性siRNA抑制G-MDSCs中lncRNA AK036396的表达后,利用qRT-PCR与Western-blot检测细胞中靶分子Fcnb的表达变化。3.利用荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH )确定 lncRNA AK036396在G-MDSCs细胞中定位;利用RNA pull down与RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验确认 lncRNA AK036396与Fcnb蛋白是否存在结合;利用特异性siRNA敲减G-MDSCs中lncRNA AK036396后,加入蛋白合成抑制剂环已酰亚胺(Cycloheximide, NCX )(40μg/mL),随后利用 Western-blot 确认 lncRNAAK036396 对 Fcnb 蛋白稳定性的调控;利用特异性siRNA敲减G-MDSCs中lncRNA AK036396后,加入蛋白酶体抑制剂MG132 (20pM),随后利用Western-blot确认lncRNAAK036396对Fcnb蛋白稳降解的调控;利用特异性siRNA敲减G-MDSCs中lncRNA AK036396后,随后通过免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)实验确认lncRNAAK036396对Fcnb蛋白泛素化的调控。4.为了确认Fcnb与G-MDSCs发育及功能的联系,利用小鼠Fcnb特异性siRNA敲减肿瘤组织来源G-MDSCs中Fcnb后,检测①利用qRT-PCR检测细胞中CD244的表达;②G-MDSCs免疫抑制功能变化,其中包括:利用比色法检测精氨酸酶1 (Arginase1,Arg1)活性、利用3H-TdR掺入实验确认G-MDSCs对T细胞增殖的抑制作用、利用流式细胞术(Flow cytometry, FCM)检测活性氧(Reactive oxygen species, ROS)表达。5.肿瘤局部注射小鼠Fcnb特异性siRNA后,①连续监测肿瘤生长情况;②使用FCM检测肿瘤组织中G-MDSCs比例;③利用qRT-PCR检测肿瘤来源G-MDSCs中CD244表达情况;④肿瘤局部G-MDSCs免疫抑制分子表达变化,其中包括:利用比色法检测Arg1活性、利用FCM检测ROS表达;⑤FCM检测脾脏、引流淋巴结、肿瘤局部CD3+CD4+IFN-γ+ T细胞和CD3+CD8+IFN-γ+ T细胞比例。6.为了确定lncRNA AK036396对G-MDSCs发育及功能的调控,利用小鼠lncRNA AK036396特异性siRNA敲减肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNAAK036396后,①检测G-MDSCs发育变化,其中包括:使用qRT-PCR和Western-blot检测Fcnb的表达、使用qRT-PCR检测CD244的表达、通过瑞氏-吉姆萨染色检测细胞形态学改变;②检测G-MDSCs免疫抑制功能变化,其中包括:利用比色法检测Arg1活性、利用3H-TdR掺入实验确认G-MDSCs对T细胞增殖的抑制作用、利用FCM检测ROS表达。7.肿瘤局部注射小鼠lncRNA AK036396特异性siRNA后,①连续监测肿瘤生长情况;②FCM检测肿瘤组织中G-MDSCs比例;③利用qRT-PCR与Western-blot检测肿瘤局部G-MDSCs中Fcnb的表达,利用qRT-PCR检测肿瘤局部G-MDSCs中CD244的表达;④肿瘤局部G-MDSCs免疫抑制分子表达变化,其中包括:利用比色法检测Arg1活性、利用3H-TdR掺入实验确认G-MDSCs对T细胞增殖的抑制作用、利用FCM检测ROS表达;⑤FCM检测脾脏、引流淋巴结、肿瘤局部 CD3+CD4+IFN-γ+ T 细胞和 CD3+CD8+IFN-γ+ T 细胞比例。8.利用qRT-PCR检测肺癌患者外周血单个核细胞(PBMCs)中小鼠Fcnb同源物M-ficolin的表达水平,并分析M-ficolin的表达水平与肺癌发展之间的联系。结果:1.与野生型小鼠脾脏来源CD11b+Ly6G+细胞相比,lncRNAAK036396在肿瘤来源G-MDSCs中高表达(P0.001);与外周成熟中性粒细胞(P0.001)、单核细胞(P0.001)以及肿瘤来源 M-MDSCs (P0.001)相比,lncRNAAK036396 在荷瘤小鼠肿瘤来源G-MDSCs中高表达;lncRNAAK036396的表达随着G-MDSCs分化发育逐渐下降(P0.05)。2.与野生型小鼠脾脏来源CD11b+Ly6G+细胞相比,Fcnb在肿瘤来源G-MDSCs中高表达(P0.01);与外周成熟中性粒细胞(P0.001)、单核细胞(P0.001)以及肿瘤来源M-MDSCs (P0.001)相比,Fcnb在荷瘤小鼠肿瘤来源G-MDSCs中的表达水平最高;在肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNAAK036396表达被抑制后,FcnbmRNA (P0.05)与蛋白(P0.05)表达发生显著下调。3.通过FISH实验发现lncRNAAK036396主要位于肿瘤来源G-MDSCs细胞核中;通过RNA pull down和RIP实验证实lncRNAAK036396与Fcnb蛋白之间存在相互结合;Western-blot结果显示在抑制G-MDSCs中lncRNAAK036396表达后,Fcnb蛋白稳定性显著下调;Western-blot结果显示在抑制蛋白酶体活性后,siAK036396无法继续下调Fcnb蛋白稳定性;IP结果显示,抑制lncRNAAK036396表达后,Fcnb蛋白结合的泛素水平显著升高。4.利用小鼠Fcnb特异性siRNA敲减肿瘤组织来源G-MDSCs中Fcnb后,①CD244的表达显著下调(P0.01);②Arg1活性显著下调(P0.05)、ROS表达显著下调(P0.05)、G-MDSCs对CD4+T细胞增殖的抑制作用下调(P0.05)。5.肿瘤局部注射小鼠Fcnb特异性siRNA后,①肿瘤生长被有效延缓(P0.05);②肿瘤组织中G-MDSCs比例发生显著下调(P0.05);③肿瘤来源G-MDSCs中CD244的表达显著下降(P0.05);④肿瘤局部来源G-MDSCs中Arg1活性(P0.01)、ROS表达(P0.05)均发生显著下调;⑤脾脏(P0.05)、肿瘤局部(P0.05) CD3+CD4+IFN-γ+T细胞比例出现显著上调。同时,脾脏(P0.05)、肿瘤局部(P0.05) CD3+CD8+IFN-γ+T细胞比例出现显著上调。6.在肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNAAK036396表达被抑制后,①Fcnb(P0.05)和CD244 (P0.01)表达均发生显著下调,G-MDSCs形态学特点由杆状核为主分页核少见转变为多见分页核;②Arg1活性显著下调(P0.05)、G-MDSCs对CD4+T细胞增殖的抑制作用下调(P0.05),但是ROS的表达未出现显著变化(ns=no significance)。7.肿瘤局部注射小鼠lncRNA AK036396特异性siRNA后,①肿瘤生长被有效延缓(P0.001);②肿瘤组织中G-MDSCs比例发生显著下调(P0.01);③肿瘤局部来源G-MDSCs中Fcnb (P0.01)与CD244 (P0.001)的表达显著下调;④肿瘤局部来源G-MDSCs中Arg1活性(P0.05)与ROS的表达(P0.001)发生显著下调;⑤脾脏(ns)、引流淋巴结(ns)、肿瘤局部(ns) CD3+CD4+IFN-γ+T细胞比例未出现显著变化。但是脾脏(P0.05)、引流淋巴结(P0.05)、肿瘤局部(P0.05) CD3+CD8+IFN-γ+T细胞比例均出现显著升高。8.与健康对照相比较,肺癌患者PBMCs中M-ficolin (小鼠Fcnb的同源物)的表达水平显著升高(P0.05)。肺癌患者PBMCs中M-ficolin表达水平与MDSCs比例及Arg1表达水平呈现明显的正相关(P0.01, P0.05)。且M-ficolin的表达水平与肿瘤大小(P0.05)、淋巴结转移(P0.001)、TNM分期(P0.05)密切相关。结论:LncRNAAK036396在肿瘤来源G-MDSCs中的表达呈现阶段特异性与细胞特异性。LncRNAAK036396通过Fcnb能够有效调控G-MDSCs免疫抑制功能进而影响机体抗肿瘤免疫。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R730.51

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 江汇涓;邵宗鸿;;MDSC的功能研究进展与应用前景[J];临床血液学杂志;2013年03期

2 吉清,郑英如,李蓉芬,钟小林,高会广,何凤田;人可溶性B淋巴细胞刺激因子结合小肽的筛选及其免疫抑制功能分析[J];中华风湿病学杂志;2004年11期

3 庄书斐,叶其壮;肿瘤血管生成的分子机制及其治疗前景[J];中国药理学通报;2000年02期

4 于新蕊;感染可能会阻断肿瘤中血管生成[J];医学信息;2001年11期

5 杨毅军;血管内皮生长因子与肿瘤血管生成[J];中国普外基础与临床杂志;2001年03期

6 李俊;肿瘤血管生成与抗血管生成疗法[J];实用医学杂志;2002年10期

7 陶旭辉,唐德才;肿瘤血管生成及中药抗肿瘤血管生成研究进展[J];中药材;2003年05期

8 李利亚,唐劲天;肿瘤治疗的抗肿瘤血管生成策略[J];中日友好医院学报;2003年01期

9 李莹,王志华;抗血管生成疗法治疗肿瘤的研究进展[J];国外医学(免疫学分册);2004年03期

10 王诗华,曾仁杰,王豫蓉,谭永红,谢军;碱性成纤维细胞生长因子与肿瘤血管生成研究进展[J];西南国防医药;2004年04期

相关会议论文 前10条

1 季宇彬;周婷婷;邹翔;;肿瘤血管生成及其供血模式研究进展[A];全国第十一届生化与分子药理学学术会议论文集[C];2009年

2 王瑞平;薛维伟;;中药抗肿瘤血管生成研究近况[A];肿瘤药物及肿瘤传统医学治疗研究[C];2005年

3 蔡彦;许世雄;Quan Long;;力学环境影响下的实体肿瘤血管生成数值模拟[A];2008年全国生物流变学与生物力学学术会议论文摘要集[C];2008年

4 张敏鸣;;肿瘤血管生成的影像学研究进展[A];中华医学会第十三届全国放射学大会论文汇编（上册）[C];2006年

5 张敏鸣;;肿瘤血管生成的影像学研究进展[A];中华医学会第十三届全国放射学大会论文汇编（下册）[C];2006年

6 寿成超;董志伟;;抗血管生成与肿瘤治疗[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议教育集[C];2006年

7 寿成超;;肿瘤血管生成与抗肿瘤小肽药物的研发[A];2007医学前沿论坛暨第十届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2007年

8 苏亚辉;冯勤;宋述梅;安平;雷和田;姜北海;寿成超;;肿瘤血管生成与抗肿瘤小肽药物的研发[A];2008年中国病理生理学会第十一届肿瘤和第十二届免疫专业委员会学术会议论文集[C];2008年

9 陈平华;李岩;;桦树皮有效部位抑制肿瘤血管生成研究[A];全国第十一届生化与分子药理学学术会议论文集[C];2009年

10 高昊;许世雄;赵改平;王庆伟;浏丹;Collins MW;;肿瘤血管生成的二维数值模拟和血液动力学[A];中国力学学会学术大会'2005论文摘要集（上）[C];2005年

相关重要报纸文章 前10条

1 解放军总医院第一附属医院肿瘤科主任 肖文华　整理 张献怀;抗肿瘤血管生成可能有助消腹水[N];健康报;2008年

2 吴厚容　车习耕　郑耕宇;肿瘤治疗进入基因医学新时代[N];健康报;2006年

3 记者 李颖;抗肿瘤血管生成药安维汀被广泛应用[N];科技日报;2011年

4 本报记者 谭嘉 张磊 通讯员 冯毅;擒获肿瘤血管生成元凶[N];健康报;2013年

5 张前 赵言群 解华;研究表明多种中药对肿瘤血管生成有影响[N];中国医药报;2006年

6 张旭;“安维汀中外学者交流计划”正式启动[N];中国医药报;2010年

7 ;肿瘤“饥饿”疗法高交会上备受关注[N];深圳商报;2004年

8 记者 顾泳;首个抗肿瘤血管生成药国内上市[N];解放日报;2010年

9 张丽 徐文方;肿瘤血管生成抑制剂研究热潮难挡[N];中国医药报;2005年

10 ;新世纪肿瘤治疗出现三大新动向[N];中国医药报;2002年

相关博士学位论文 前10条

1 田新宇;LncRNA AK 036396对粒细胞样髓源抑制性细胞免疫抑制功能的调控机制及其在抗瘤免疫中的作用[D];江苏大学;2017年

2 杨光杰;靶向整合素αvβ3新型探针制备及卵巢癌显像和抗瘤血管药效监测研究[D];山东大学;2015年

3 张斌;CD39/CD73分子在胃肠癌患者中的表达及临床意义研究[D];第二军医大学;2015年

4 李丹;肿瘤血管生成和媒介传染病相关问题的建模与稳定性分析[D];北京科技大学;2016年

5 姜为为;ERK5在肿瘤发展、转移及放疗抗性中的作用[D];南京大学;2011年

6 滕飞;肿瘤相关成纤维细胞影响子宫内膜癌发展的研究[D];天津医科大学;2014年

7 欧阳志钢;力达霉素抗肿瘤血管生成的实验研究[D];中国协和医科大学;2006年

8 赵宗磊;超声微泡破坏抑制肿瘤生长及其作用机制研究[D];南方医科大学;2013年

9 沈圆圆;冷热交替条件下的肿瘤微循环损伤及机理研究[D];上海交通大学;2009年

10 刘建国;以肿瘤血管生成为靶标的抗转移实验研究[D];中国协和医科大学;1994年

相关硕士学位论文 前10条

1 丁一心;CD40分子调控MDSC向胃癌微环境迁移的机制[D];苏州大学;2015年

2 刘岩;中药成分小檗碱抗肿瘤新生血管形成作用的研究[D];湖北中医药大学;2015年

3 高嵩;新型RGD PET/CT显像整合素αvβ3在疑似肺癌患者中的初步研究[D];济南大学;2015年

4 王晓盈;基于多肽的两种肿瘤标志蛋白检测新方法的研究[D];南京医科大学;2014年

5 于娅;地榆活性成分抑制肿瘤血管生成作用及机理研究[D];成都中医药大学;2015年

6 唐健;新型金属蛋白酶ADAMTS-18在肿瘤发生、发展和转移中的作用及机制研究[D];华东师范大学;2014年

7 潘宜云;卵巢癌浸润NK细胞与肿瘤血管生成的相关性研究[D];昆明医科大学;2016年

8 李萍;蛴螬多糖的提取分离、结构特征与抗肿瘤作用的研究[D];第四军医大学;2016年

9 刘亚蓉;Dll4靶向纳米药物抗血管生成治疗肿瘤的研究[D];上海交通大学;2015年

10 魏霞;miRNA对Cripto-1高表达的肿瘤细胞增殖及侵袭的调控作用及机制研究[D];东北师范大学;2016年

，

本文编号：1754217