C6神经酰胺增敏长春新碱抗肿瘤作用机制研究

发布时间：2018-04-18 00:02

本文选题：磷酸腺苷激活的蛋白激酶 + C6神经酰胺　；参考：《苏州大学》2015年博士论文

【摘要】：研究背景和目的传统肿瘤化疗药(如长春新碱)使用存在严重局限,肿瘤细胞对传统肿瘤化疗药存在先天或获得性耐药,这是由于药物转运蛋白水平或活性的改变,以及影响药物的活性和/或代谢的蛋白的影响。化疗增敏蛋白一直是癌症研究的一大焦点。许多研究者已经发现的短链细胞渗透性神经酰胺(C6)的活性,以增加现有的化疗药物的抗肿瘤活性。C6神经酰胺显著提高的多个抗癌药物的活性,包括紫杉醇、阿霉素和组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)。但这个增敏的分子机制仍然是不明确。长春新碱是一种常用的抗癌化疗药物。它是一种细胞周期特异性的药物,结合于微管蛋白,抑制微管结构的组装和阻止有丝分裂的中期,使癌细胞不能发生有丝分裂。它已被广泛地应用于各种类型的化疗方案用于治疗患者肿瘤,在不同的癌症中其有效率变化大,使用后癌细胞会表现出耐药的趋势发展。长春新碱诱导癌细胞死亡的分子机制仍然不清楚。我们以前的研究已经表明,激活AMP活化蛋白激酶(AMPK)可能是介导长春新碱活性的关键信号。我们团队一直注重AMPK对癌细胞的抑制能力。持续激活AMPK示通过调节多个下游信号的目标来诱导癌细胞死亡和生长抑制,包括在活化的mTOR复合体1(mTORC1)、磷酸化的p53、激活自噬,等等。这里我们显示,在多个人类癌细胞系中,无论是在体内和体外,C6神经酰胺显著地提高了长春新碱诱导的抗癌活性。在分子水平上,我们发现AMPK依赖性p53活化可能是介导的敏化效应关键的信号。研究方法和材料人结肠癌HCT-116细胞,人胰腺癌PANC-1细胞和人卵巢癌A2780细胞中,所有细胞均从上海生命科学研究院(上海,中国)购买,并维持在RPMI/DMEM培养基中(Sigma公司,圣路易斯,密苏里州),加入10%的FBS(Sigma公司,圣路易斯,密苏里州),青霉素/链霉素(1:100,Sigma),培养在37℃CO 2培养箱中。细胞给予指定的c6神经酰胺和或长春新碱处理,显微镜下观察细胞形态,运用mtt方法检测细胞存活率,同时对细胞进行台盼蓝染色,计算活细胞率;运用组蛋白dna-elisa及annexinv试剂盒检测细胞凋亡,ldh分析法检测细胞死亡率,线粒体免疫共沉淀分离线粒体,通过jc-10染料测定细胞线粒体膜电位(mmp),westernblot检测总的和磷酸化的ampkα、acc、p53、cyp-d、bcl-2、hif-1α、s6k1等信号通路的改变;运用程序性死亡抑制剂及凋亡抑制剂进一步验证c6神经酰胺和长春新碱诱导细胞死亡方式。建立cyp-d-shrna、p53-shrna、ampkα1-shrna及ampk-α1显性失活(dn)突变(dn-ampk-α1)cdna稳转的肿瘤细胞,运用上述方法进一步验证信号通路的改变。制备脂质体c6神经酰胺,运用上述方法验证其体外活性,建立裸鼠模型,予以分组静脉给药,记录裸鼠存活率,肿瘤大小,免疫组化检测组织ampkα表达,进一步验证脂质体c6神经酰胺增强长春新碱的抗肿瘤机制。统计学处理在每个实验中,至少使用三个孔/平皿。每个实验重复至少三次,每次获得具有相似的结果。数据以均数±标准偏差(sd)。使用spss15.0软件进行分析统计,通过one-wayanova,scheffe和tukey检验。p0.05被认为有统计学意义。试剂的浓度和治疗持续时间基于发表文献和预实验的结果。研究结果1、c6神经酰胺在多个人肿瘤细胞系显著提高了长春新碱诱导的肿瘤细胞毒性。长春新碱单独只有适度抑制hct-116结肠癌细胞存活,与c6神经酰胺共同用药显著增加长春新碱的活性,从而导致细胞活力大幅降低。c6神经酰胺的效果是剂量依赖性的,2.5-10.0μg/ml的c6能够显著增加长春新碱的活性,而c6神经酰胺本身对hct-116细胞的存活率几乎没有影响。c6神经酰胺和长春新碱联合给药导致了大量的细胞死亡,并且联合效果比任一单独药剂显著高。另外两个人癌细胞系a2780卵巢癌细胞和panc-1胰腺肿瘤细胞,同样观察到协同作用。2、c6神经酰胺促进长春新碱诱导的凋亡和程序性坏死。使用组蛋白dna的elisa测定法和膜联蛋白vfacs测定法进行细胞凋亡的检测,结果表明,长春新碱(1μm)单独用药仅诱导极少的hct-116细胞凋亡,而与c6神经酰胺(10μg/ml)共用药显著增强效果。c6神经酰胺对细胞凋亡的增敏作用几乎被广谱caspase抑制剂z-vad-fmk抑制。通过ldh释放的增加检测长春新碱诱导的hct-116细胞程序性坏死,c6神经酰胺的共同用药处理明显增加细胞程序性坏死,而坏死抑制剂necrostatin-1(nec-1)抑制了联合用药的效果。重要的是,z-vad-fmk或nec-1单独可部分抑制c6神经酰胺加长春新碱诱导的细胞毒性,但两者联合可几乎阻断。需要注意的是nec-1比z-vad-fmk减轻细胞毒性更有效。类似的结果在a2780卵巢癌细胞和panc-1胰腺癌细胞中也见到。3、c6神经酰胺和长春新碱协同激活ampk依赖性的mtorc1的抑制以及细胞凋亡和程序性坏死。westernblot的结果表明,在hct-116细胞和a2780细胞中,c6神经酰胺和长春新碱协同活化ampk通道,比任一药物单独使用更有效。通过磷酸化s6k1(thr-389)的检测反应mtorc1活化的,并且对mtorc1依赖性基因,包括bcl-2和hif-1α的表达的检测,发现共同用药后比单药mtorc1相关蛋白水平显著下调。类似的结果在a2780细胞中也见到。在共同给药刺激的肿瘤细胞中,无论是ampk的激活抑制,还是由基因沉默(shrna敲低表达)或通过引入显性失活(dn)的突变,都可恢复s6k1磷酸化和bcl-2/hif-1α的表达。重要的是,在hct-116细胞中,c6神经酰胺加长春新碱引起的细胞活力下降,细胞凋亡和细胞坏死都被ampk沉默或失活突变所抑制。4、c6神经酰胺和长春新碱协同诱导ampk依赖的p53激活,使其易位到线粒体,与线粒体通透性转换孔(mptp)相关蛋白亲环素d(cyp-d)络合形成复合物。c6神经酰胺或长春新碱单独诱导hct-116细胞中度p53的活化(磷酸化和上调)。两者联合用药引起p53的活化进一步增加,抑制ampk(shrna沉默或基因突变)抑制p53活化。westernblot检测线粒体蛋白质表明c6神经酰胺加长春新碱导致p53的转位到线粒体,p53和磷酸化p53两者都前往线粒体。此外,线粒体-ip实验结果表明,p53的易位与cyp-d的形成复合物,这个复合物被ampk或cyp-d的沉默所抑制。另外,westernblot检测表明通过共同给药后p53基因易位被ampk沉默抑制,但不被cyp-d沉默抑制。反之,ampk激活aicar诱导p53的激活,导致p53线粒体易位,以及与cyp-d结合。通过jc-10染料检测刺激后hct-116细胞中的mmp,结果表明,c6神经酰胺和长春新碱协同降低mmp,比单独给药更有效。通过相对应的shrna沉默ampk或cyp-d抑制联合用药所诱导的mmp减少。5、线粒体蛋白质cyp-d需要的c6神经酰胺和长春新碱联合给药引起坏死,但不是凋亡。Cyp-D抑制剂环孢菌素A(CSA)以及shRNA敲低Cyp-D几乎阻断联合用药诱导的细胞坏死,而留下的细胞凋亡不受影响。C6神经酰胺加长春新碱诱导的细胞活力降低被Cyp-D-抑制减少。通过的shRNA沉默p53不仅抑制联合用药诱导的坏死,而且还抑制了细胞凋亡。6、脂质体的C6神经酰胺在体外和体内高效增敏长春新碱的活性。根据以前的操作规程成功合成了脂质体C6神经酰胺。体外研究结果表明,该脂质体C6神经酰胺增强长春新碱诱导的HCT-116细胞和A2780细胞活力降低和凋亡,并且比非脂质体的C6神经酰胺具有更高的效率。在体内,脂质体C6神经酰胺加长春新碱联合对小鼠模型给药,发现HCT-116或A2780异种移植生长受到显著抑制。脂质体的C6神经酰胺或长春新碱作为单一给药,发现HCT-116或A2780在体内生长的只略微受到抑制。IHC检测结果表明,在肿瘤异种移植模型中脂质体的C6神经酰胺和长春新碱联合给药(48小时)也可诱导显著AMPK磷酸化/活化,并与非脂质体的C6神经酰胺的结果相一致。小鼠体重也不受上述药物使用的影响。结论1、C6神经酰胺大幅增敏长春新碱诱导肿瘤细胞凋亡和程序性坏死。2、C6神经酰胺和长春新碱协同激活AMPK-P53,调节细胞凋亡和程序性坏死。3、联合用药后AMPK的活化导致mTOR抑制和Bcl-2/HIF-1α的降解。4、联合用药后AMPK依赖性的p53与Cyp-D-线粒体结合介导程序性坏死。5、在体外和体内脂质体C6神经酰胺敏化长春新碱诱导的活性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.5

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