AT富集序列特异性结合蛋白1促进前列腺癌细胞增殖和侵袭的实验研究

发布时间：2018-04-19 03:04

本文选题：SATB-1 + 前列腺癌　；参考：《南方医科大学》2016年博士论文

【摘要】：全国肿瘤登记中心的数据显示,前列腺癌是近几年来,中国大陆地区发病率逐年爬升的恶性肿瘤之一。随着我国居民生活水平的提高和生活方式的改变,特别是近年来,人口老龄化和饮食结构的变化,我国前列腺癌的发病率正呈现较快的上升趋势,已跃居泌尿生殖男性系统恶性肿瘤的第3位,仍有进一步升高的趋势。因为前列腺特异性抗原(Prostate Specific Antigen, PSA)等普查不够普及,我国的初发即表现为晚期的前列腺癌患者比例远高于西方国家,这一现象在农村地区尤为突出。在我国,前列腺癌患者初诊时常常已经是肿瘤晚期,其中大约有40%的人已经出现有局部或远处淋巴结转移、骨转移,仅仅小于30%的患者有手术机会,导致我国前列腺癌患者的普遍预后较差。已有的各项研究表明,诸多危险因素参与了前列腺癌的发生和进展。尽管在前列腺癌基因水平的研究取得众多新进展,但是转移性前列腺癌的有效临床治疗仍然面临严峻的挑战。进一步的解剖、病理、影像等研究发现,当诊断为前列腺癌时,前列腺肿瘤细胞已经侵犯到前列腺外科包膜,甚至发生区域性淋巴结转移。通过研究前列腺癌的发生原因、发展机制,并在此基础上寻找前列腺癌的治疗方法,成为泌尿外科领域的重要研究课题。PCa的发生是一个异常复杂的过程,诸多遗传、种族、年龄、生活习惯、环境等因素与其相关：肿瘤的产生又经过多个步骤和多个阶段。早在1941年,Huggins等首先报告了前列腺癌的雄激素依赖,并采取外科去势的方式治疗前列腺癌,取得了明显的治疗疗效。临床通过手术或药物去势,同时使用雄激素受体括抗剂来降低体内雄激素水平,完全性雄激素阻断治疗仍然是目前治疗前列腺癌的重要方法。由于发生突变或者翻译后的修饰,雄激素受体的功能缺失,最终导致细胞对雄激素产生耐受。近期的研究也发现在雄激素受体非依赖性的前列腺癌中,雄激素受体的信号与丝裂原活化蛋白激酶、雷帕霉素哺乳动物靶蛋白、磷脂酰肌醇3-激酶等信号转导通路间复杂的调节机制,使得多重信号转导有效的发挥其作用。临床大量的研究发现,相当多数量的前列腺癌患者,经过标准内分泌治疗16-24个月后,很容易演变为去势抵抗型前列腺癌,表现为雄激素剥夺不敏感,肿瘤恶性程度更高,而且临床缺乏成熟的治疗手段。对于晚期前列腺癌患者,目前尚无确切有效的治疗措施,通常只能采取综合的保守治疗方法。近年来,阿比特龙和恩杂鲁胺的临床研究带来了一线生机,但尚待上市后大规模临床研究证实其价值。当患者发生骨转移后,生存期通常不超过24个月。因此寻找高特异性前列腺癌标记物,提高早期确诊率,成为提高前列腺癌治疗效果的关键。研究前列腺癌向CRPC转化发生和进展的分子机制,对于早期筛查和开发靶向治疗药物等,都具有重大意义。最近涌现的基因芯片技术和蛋白组学技术等研究手段,为进一步探索CRPC发生及发展提供了新的路线图。AT富集序列特异性结合蛋白-1(Special AT rich sequence binding Protein-1, SATB-1)是一种组织特异性表达的核基质结合蛋白,人类SATB-1基因定位于3号染色体3p23区,全长共763个氨基酸。1992年由Dickinson等使用免疫球蛋白重链μ链增强子核基质结合区(MARs)为探针克隆出。SATB-1是一种基因调节因子,主要表达于胸腺细胞和前B细胞中,具有细胞类型特异性的核基质结合域DNA结合蛋白。SATB-1通过多种途径调节肿瘤的生物学行为,从而抑制肿瘤形成或促进肿瘤的生成。SATB-1基因表达的调节,控制着多个细胞过程,包括细胞凋亡和增殖。近年来的研究发现,SATB-1在众多肿瘤发挥着重要作用,通过免疫调节、凋亡调控影响肿瘤的发生、进展及转移。肿瘤的复发与转移主要是细胞出现转移及侵袭的结果,在早期,癌细胞从邻近细胞中逃离然后浸涧到周围细胞层,这些肿瘤细胞会丢失细胞与细胞之间的黏着,并获得迁移能力。通过上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)上皮细胞获得迁移能力。研究证实上皮-间质转化可通过多种机制来促进肿瘤侵袭和扩散的级联反应,是肿瘤发生浸润和转移的基础。新近的研究证据表明,SATB-1的过度表达下调钙粘附蛋白E(E-cadherin)的基因表达,进而促进肿瘤细胞EMT的进一步发生。越来越多的证据表明,SATB-1与肿瘤侵袭能力和转移关系密切,甚至导致肿瘤的不良预后。不过SATB-1是如何促进肿瘤侵袭,以及如何导致肿瘤转移的确切机制尚不清楚。SATB-1作为一种核基质结合区(Matrix Attachment Region, MAR)蛋白,通过与MAR序列结合,参与染色体重塑、核小体定位、调节基因表达以及组蛋白修饰等过程,并在免疫调节、肿瘤转移和凋亡方面具有重要的作用。新近的研究表明SATB-1在肺癌细胞、乳腺癌细胞等组织中高度表达,可能与肿瘤的进展、预后不良等有密切相关。研究表明,SATB-1的表达可以在肿瘤细胞中诱导出明显的基因表达的改变,从而使相应的肿瘤细胞变得更有侵袭性,从而在肿瘤的发生和转移的出现等过程中起了关键作用。基于以上背景,SATB-1被视为肿瘤研究领域的有价值的新靶点。然而,SATB-1促进肿瘤侵袭和转移的确切机制均尚不明确。在前列腺癌中SATB-1的表达情况和作用尚不清楚。本研究的目的是探讨和评估SATB-1对前列腺癌生物学行为的影响,以及阐明该变化是否通过上皮细胞-间充质细胞(EMT)转化途径实现。本研究旨在通过检测SATB-1在前列腺癌、及癌旁组织和典型前列腺细胞系中的表达,探讨其与前列腺癌侵袭、转移等特性的关系。本课题研究内容分三个部分第一部分：SATB-1在前列腺癌组织和前列腺细胞系中表达的实验研究目的：通过本实验明确SATB-1在前列腺癌组织以及前列腺细胞系中的表达情况,为后续的研究提供形态学依据和实验材料。方法：1)标本收集：2010年12月和2014年11月间在南方医科大学接受前列腺癌手术治疗的98例患者的前列腺癌组织和癌旁组织。2)细胞系选用与细胞培养：前列腺癌PC3、LNCaP、22RV1细胞系购自美国典型培养物保藏中心(Manassas, USA),分别保存于RPMI1640溶液中,定期补充含10%(体积/体积)胎牛血清和抗生素。DU145细胞系使用改良伊格尔培养基,定期补充含10%(体积/体积)胎牛血清、2毫摩尔的L-谷氨酰胺和抗生素。人类非致瘤性前列腺上皮细胞系RWPE-1在无血清培养基中培养,补充5毫微克/ml人重组表皮生长因子和30mg/ml牛垂体提取物(Invitrogen,加利福尼亚州)。培养细胞系维持37℃,5%CO2的潮湿环境。3)免疫组化：对于SATB-1表达的免疫组织化学分析,使用自动切片,厚度4um,自动染色系统预处理,用抗SATB-1抗体标记(Abcam公司)。至少有1%癌细胞中出现任何强度的核阳性,被认为SATB-1阳性表达。在任何原发性肿瘤或淋巴结转移的细胞核阳性病例被认为是阳性表达,间质淋巴细胞作为SATB-1的阳性对照。4)RNA提取和实时定量PCR测定：根据试剂操作(Invitrogen, USA)的说明,从冷冻组织样品、细胞系,使用Trizol试剂提取总RNA并纯化。定量RT-PCR使用随机引物和反转录试剂盒(Takara, China)。在20微升的反应体积中,从总RNA逆转录cDNA。反转录在37℃下进行15分钟,然后在85℃维持5秒。使用Power SYBR Green (Takara, China)系统的标准流程进行实时定量RT-PCR分析。所有的操作均按照说明要求完成,并进行标准化对照。5)引物合成：引物由上海生工生物工程技术服务公司(上海,中国)合成。基因特异性引物为SATB-1的序列(正向,5'GTGGAAGCCTTGGGAATCC-3';反向,5'-CTGACAGCTCTTCTTCTAGTT-3')和GAPDH(正向,5'-TCGGAGTCAACGGATTTGGTCGT-3';反向,5'-TGCCATGGGTGGAATCATATTGGA-3-')。使用ABI7500平台进行定量RT-PCR测定和数据收集,每个样品一式三份进行分析。6) Western Blot印迹分析：使用哺乳动物细胞全蛋白提取试剂盒RIPA(碧云天),补充有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和PMSF (Roche)的裂解产物。蛋白质通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,并转移至0.22毫米硝化纤维素(NC)或聚偏二氟乙烯膜上(Sigma).将膜洗涤、固定,并且与特定的初级抗人抗体温育。SATB-1抗体购自Abcam公司(Cambridge, USA),二级抗体是辣根过氧化物酶结合的羊抗兔IgG。底物显色及条带的强度通过Bio-Rad公司定量分析软件进行光密度测定的定量分析。结果：通过免疫组化检查、定量RT-PCR和免疫印迹分析98对PCa的组织样本和癌旁组织样本的SATB-1的表达水平,比较后发现,SATB-1的表达在癌组织与癌旁组织出现显著上调。进一步的观察表明,SATB-1蛋白主要位于细胞核中。在77/98(78.57%)例前列腺癌病例中观察到SATB-1的阳性染色,在相邻的癌旁组织标本中阳性表达的比例为18/98(18.36%),但两者有显著统计学意义(P0.001)。结论：定量RT-PCR和免疫印迹的结果表明,肿瘤组织比癌旁组织表现出更高水平的SATB-1 mRNA和蛋白质。此外,我们研究了在前列腺细胞系以及永生化非致瘤性人前列腺上皮细胞系RWPE-1 SATB-1的表达。相比RWPE-1细胞系,SATB-1的mRNA和蛋白水平在所有人类前列腺癌细胞系大大升高。SATB-1的表达水平在不同前列腺细胞系之间有一定差异。第二部分：SATB-1促进前列腺癌细胞增殖的实验研究目的：探讨SATB-1对前列腺癌细胞增殖的影响方法：1)细胞转染：SATB-1表达载体选用pcDNA3.1,构建沉默SATB-1的特异性shRNA pGenesil2-SATB-1,选用lipofectamin转染细胞(Invitrogen,USA).转染后,孵育24小时,然后用G418筛选(400毫克/毫升)稳定转染克隆。其后,挑选稳定的细胞单菌落,并在含有200毫克/毫升G418的培养基上进一步培养。所有后续研究使用的稳定细胞系均从单菌落进行培养。用pcDNA3.1或pGenesil2载体转染的细胞作阴性对照。2)MTT法：转染成功后,将细胞在96孔板中用104细胞/孔的密度接种。此后,更换培养基,细胞用20微升的MTT (5mg/ml; Sigma)培养4小时。该混合物以12,000转/min在4℃下进行10分钟离心。除去上清液,加入50微升的DMSO到每个孔中,并且将溶液搅拌均匀后上脱色摇床10分钟。用酶免疫分析仪(BioTek)测定每个孔在490nm的光密度(OD)值。3)细胞增殖的抑制率(抑制率,IR)的计算如下：IR=(1-实验组的平均OD值/对照组的平均OD值)×100%。使用不同浓度的细胞增殖抑制率,计算50%抑制浓度(IC50)。结果：LNCaP细胞被用来建立SATB-1过表达的细胞系,并用DU145细胞系通过病毒转染,建立SATB-1沉默细胞系。SATB-1的过度表达(指LNCaP-SATB-1)和沉默SATB-1表达(指DU145-shSATB-1),细胞系中的表达水平通过qRT-PCR和Western印迹验证。在LNCaP-SATB-1细胞系,SATB-1 mRNA的定量RT-PCR显示表达水平与对照组相比有显著增加；蛋白质印迹显示SATB-1蛋白在LNCaP-SATB-1细胞中的表达显著增高；与对照组相比,在DU145-shSAT SATB-1细胞系,mRNA的定量RT-PCR显示表达水平显著降低；蛋白质印迹显示DU145-shSAT SATB-1细胞系蛋白的表达降低显著。结论：通过MTT研究表明,LNCaP-SATB-1细胞系与对照相比,细胞增殖显著增加；与此相反,DU145-shSATB-1细胞系细胞增殖的比例较低。因此,研究认为SATB-1表达影响前列腺细胞增殖。第三部分：SATB-1调控前列腺癌细胞迁移和侵袭的实验研究目的：探讨SATB-1对体外Transwell小室前列腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响方法：Transwell小侵袭实验：细胞侵袭实验使用8毫米孔径Transwell小室,将悬浮于无血清培养基的转染后细胞接种到上部室,补充有10%FBS的置入下室。经过24小时后,已通过膜表面侵入的细胞用甲醇固定,用结晶紫染色10分钟,并计数,测定侵袭结果。结果：进行迁移和侵袭实验研究结果表明,经过沉默SATB-1处理的DU145-细胞与LNCap SATB-1表达组相比,其迁移和侵袭能力显著减少。pcDNA3.1载体空转染组和对照组之间无显著差异。结论：前列腺癌细胞系的体外研究证实,在LNCaP细胞的SATB-1表达,能促进他们的迁移和侵袭能力。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25

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