肝癌转移分子机制的定量膜蛋白质组研究

发布时间：2018-05-04 08:40

  本文选题：HepaRG + 定量膜蛋白质组学　； 参考：《中国人民解放军军事医学科学院》2016年博士论文

【摘要】：在我国,每年有超过30万人死于肝癌,占全世界因肝癌死亡患者的55%以上。作为“癌中之王”的肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)在原发性肝癌中的比例超过90%。肝癌具有恶性程度高、发生发展迅速、容易转移和复发以及预后生存期短的特点。由于缺乏早期肝癌诊断相关的生物标志物,临床诊断主要依靠检测AFP(α-fetoprotein,甲胎蛋白)表达和采用医学影像如B超等进行早期筛查。但是AFP阳性率与肝癌只有70-80%的相关性以及B超难于诊断早期的小体积肝癌等缺点,使得肝癌早期诊断难于实现。手术切除仍是肝癌治疗的首要选择,但是HCC易转移的特征使肝癌患者的术后生存期非常短。对肝癌转移相关机制进行系统的研究从而寻找与转移相关的生物标志物,对肝癌的预防、诊断和治疗具有非常重要的理论意义和应用前景。与癌症转移相关的分子机制之一是在肿瘤微环境变化如缺氧诱导引起的肿瘤组织中上皮细胞间质化转化(EMT),从而使肿瘤细胞获得转移潜能。在HCC转移过程中,由于病毒感染等因素造成的肝损伤以及HCC肿瘤微环境改变使肝脏中部分细胞的膜蛋白和胞外基质组成发生变化进而调控下游信号通路,使肝实质细胞转变成具有某些“干性”的肝祖细胞,肝祖细胞可以分化成肝癌相关成纤维细胞、间充质细胞从而发生HCC转移。因此,对EMT发生过程中的膜蛋白质组进行研究对阐述HCC发生和转移机制非常重要。本研究通过优化组合超速离心和双水相提取方法优化了膜蛋白质组样品制备的完整流程,获得了纯度接近40%的膜蛋白富集组分。在此基础上,系统比较和优化了膜蛋白的电泳分离、胶内酶切、溶液酶切、质谱数据采集和膜蛋白预测方法等。研究表明基于组合酶切(Lys C+trypsin)的胶内消化可以鉴定超过1000个膜蛋白。进一步组合RapiGest的溶液酶切和高pH-RPLC分离技术,形成了简便、快速、高效的膜蛋白质组学研究技术体系。基于该技术体系获得的HepaRG和MCF7细胞系膜蛋白数据集在膜蛋白数量上优于目前文献报道的数据集(Rui,2013,486个膜蛋白;Hu,2011,495个膜蛋白)。基于可体外培养和诱导分化的肝祖细胞系HepaRG,建立了HepaRG的体外诱导分化体系并对分化前后的膜蛋白进行iTRAQ定量膜蛋白质组学分析。对最终定量的849个膜蛋白进行差异表达筛选和IPA(Ingenuity pathway analysis)分析表明,ECM组成相关膜蛋白对HepaRG细胞的分化非常重要,多个膜蛋白参与了细胞粘附、转移和癌症相关信号通路。其中关键的蛋白包括MMP14、HYOU1、CD44、OCLN、ITGA、EGFR、ADAM9、ADAM15、CD46、CD151以及TMEM家族蛋白。这些蛋白的变化与EMT过程密切相关,进一步证明HepaRG细胞的肝祖细胞系属性。对HCC细胞系和组织样本的进一步研究表明MMP14在HCC转移中的重要作用。本研究关于HepaRG细胞分化前后的定量膜蛋白质组学数据初步阐释了该细胞分化的分子机制,为进一步研究肝组细胞在HCC发生发展中的作用奠定了基础。为了进一步研究HCC转移过程中膜蛋白参与的分子机制和潜在的膜蛋白分子标志物,对MHCC97L和HCCLM6进行基于定量膜蛋白质组学和转录组学的比较分析、IPA分析。最后基于TCGA数据库对差异基因(蛋白)在肝癌组织与癌旁组织中的表达特性以及HCC病人临床表达差异与生存期的相关性进行研究以寻找与HCC相关的膜蛋白分子标志物。无标定量膜蛋白质组学研究表明96个膜蛋白在LM6细胞中表达上调,48个膜蛋白在LM6细胞中表达下调。在转录组学测序的16,558个蛋白编码基因中,1,472个基因符合统计学分析的差异表达(log2Ratio1或者-1,p-value0.05)。IPA对转录组差异基因分析表明,细胞系的差异主要集中在胞外基质和细胞膜蛋白上;参与膜蛋白组成变化的信号通路包括TGF-β、VEGF、IL6、EGFR、TNF-α和FGF等;这些信号通路相关分子的变化都与胞外金属基质蛋白酶如MMP14介导的胶原蛋白、钙粘素、整合素代谢途径相关。转录组和定量膜蛋白质组学数据中共同差异部分基因(蛋白)的进一步IPA分析表明膜蛋白组成变化与粘附、转移和癌症的相关性。对共同差异基因(蛋白)基于TCGA数据库中HCC癌症和癌旁样本的相关表达量比较分析表明,29个基因在癌症和癌旁组织中表达差异明显,其中12个基因的表达差异具有统计学意义(p0.0001)。对差异表达基因与HCC的生存曲线的进一步分析表明ATR、CHST11、FMO3、MOCS2、NUCB2和ST6GALNAC4对HCC的转移具有非常高的相关性,这些基因可以作为潜在的膜蛋白分子标志物在临床研究中进一步研究。本文优化的多组学整合分析方法为进一步研究HCC的发生发展提供了新的研究思路。
[Abstract]:In China , more than 300,000 people died of liver cancer every year , accounting for more than 55 % of patients with liver cancer . In order to further study the molecular mechanism of membrane protein involved in HCC metastasis and to investigate the role of membrane protein in HCC metastasis .

【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
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本文编号：1842357