Endocan基因沉默对肝癌细胞存活的抑制作用及其分子机制的体外实验研究

发布时间：2018-06-24 16:10

本文选题：肝癌 + 治疗　；参考：《吉林大学》2016年博士论文

【摘要】：全球肝癌的发病率在恶性肿瘤中位居第6位,死亡率位居第3位。肝癌的治疗是以手术为主的综合治疗。由于肝癌病情的发展速度较快,且一些患者当明确临床诊断时已经失去了手术根治的机会,所以对于肝癌的治疗方法一直是医生与科研学者们探讨的热点,人们努力寻找新的治疗方法。近些年对于肝癌的治疗得到了一定的发展,除手术治疗外人们通过对肿瘤发生相关基因的靶向打击,肿瘤细胞生存代谢的通路打击,肿瘤细胞生存微环境的调节等多种方式对肝癌进行治疗。在实验室研究中,学者们不断地在探索,也取得了一定的成果,但这些进步还需要继续完善、转化、创新,希望能够得到最强的抑制肿瘤,甚至彻底消灭肿瘤,但不能够对人体正常细胞、组织带来大的伤害的方法。目前对肝癌的靶向治疗是学者们研究的热点,如利用抑癌基因去抑制肿瘤细胞生存,利用打击癌基因使其失去促进肿瘤发生、发展,通过调节肿瘤细胞血管生成,抑制肿瘤营养,促进肿瘤坏死。改变肿瘤细胞黏附能力,使其不能够定植,减弱转移能力。Endocan基因在文献报道中显示了与肿瘤细胞及肿瘤血管生成间存在着密切的关系。它可以促进肿瘤细胞的增殖,可以促进癌灶内、外血管的生成,进而为肿瘤细胞的存活提供营养支持。为了探讨Endocan基因是否能够成为肝癌治疗的靶点,本研究设计了如下的实验流程:1.选择Endocan基因沉默效果最佳的RNA干扰序列。在这节实验中设计了3条RNA干扰序列和1条阴性对照序列,通过质粒为载体将其转染入肝癌细胞SH-HEP-1中,通过各组间Endocan基因及蛋白表达检测,以干扰后基因及蛋白表达最少的组别视为干扰效果做好,选取干扰效果最佳的干扰序列进行以下各步实验。2.通过MTT和Transwell小室实验研究当Endocan基因沉默后肝癌细胞的增殖能力和侵袭能力的改变。在这节中通过未转染质粒的阴性对照组(Control组)、RNAi组(si RNA组)、阴性质粒转染组(NC组)进行对照,通过MTT法测定各组0h、24h、48h、72h、96h时间点OD值,OD值低的组别则表示增殖能力弱,通过Transwell小室实验计数成功侵袭的细胞。通过以上方法观察si RNA组的细胞增殖能力和侵袭能力能发生的变化。3.Endocan基因沉默后对肝癌细胞凋亡的影响。细胞凋亡是细胞的一种重要的程序性死亡方式,在这节中利用凋亡检测试剂盒,通过流式细胞仪检测凋亡的方法,对Control组、si RNA组、NC组细胞进行凋亡检测,观察当Endocan基因被沉默后是否会诱导细胞的凋亡的发生。4.Endocan基因沉默后对肝癌细胞自噬的影响。自噬性死亡是与凋亡并存的另一种细胞程序性死亡方式,在这节中通过检测自噬相关的蛋白的表达量,对Control组、si RNA组、NC组细胞进行自噬水平发生的评估,另外通过m RFP-GFP-LC3双荧光体系检测自噬的发生,观察当Endocan基因被沉默后是否会诱导细胞明显的自噬发生。5.Endocan基因沉默与NF-κB通路的相互影响。为了研究Endocan基因是通过怎样的通路影响细胞存活的,在本研究选取了检测细胞中一条重要的细胞信号调节通路NF-κB通路,因NF-κB行使基因调节功能时需进入细胞核内,分别检测细胞浆、细胞核内NF-κB蛋白的量,观察当Endocan基因被沉默后对NF-κB蛋白表达的影响,以及通过EMSA方法观察当Endocan基因被沉默后对NF-κB蛋白功能的影响。并进一步进行了用PDTC抑制NF-κB通路,检测Endocan蛋白的表达,从而观察NF-κB通路对Endocan表达的影响。希望从基因通路上进一步了解Endocan基因及蛋白对于细胞存活的影响。基于上述的实验研究方案进行了一系列的研究工作,在实验过程中得到了如下的结果:1.以肝癌细胞SH-HEP-1为研究对象,选择沉默效果最佳的RNA干扰序列进行Endocan基因沉默。通过MTT及Transwell小室实验观察肝癌细胞的增殖以及侵袭的能力。实验结果显示当Endocan基因沉默后,si RNA组增殖速度对比对照组明显减慢,差异具有统计学意义。能够穿过Transwell小室的细胞数明显少于Control组及NC组,差异具有统计学意义。说明si RNA组细胞侵袭能力明显减弱。2.将Endocan基因沉默,通过流式细胞仪检测细胞的凋亡,si RNA组细胞发生了晚期凋亡性死亡比例为15%左右,而对照组均未超过5%。另通过Western Blot及m RFP-GFP-LC3双荧光体系检测自噬相关蛋白发现,Endocan基因被沉默后,si RNA组发生了明显的自噬。说明Endocan基因被沉默后诱导了明显的程序性死亡。3.通过Western Blot及EMSA方法检测细胞核内、外NF-κB蛋白表达量,发现si RNA组细胞核内NF-κB量明显减少,功能性NF-κB明显减少。当抑制了NF-κB的表达后Endocan的表达也同样被明显抑制。差异具有统计学意义。Endocan与NF-κB通路间存在相互调节作用。综合上述的研究得出以下结论:Endocan基因沉默抑制肝癌细胞的增殖及侵袭;Endocan基因沉默诱导肝癌细胞程序性死亡;Endocan基因沉默通过与NF-κB通路的相互影响从而影响肝癌细胞SH-HEP-1的生存。
[Abstract]:In recent years , the authors have developed three RNA interference sequences and one negative control sequence . In order to study whether the endocan gene can be used as a target for the treatment of liver cancer , it can promote the growth of tumor cells . In this study , the effects of apoptosis on the expression of NF - 魏B in the control group , the si RNA group and the NC group were observed by means of the apoptosis detection kit . The effect of the expression of the endocan gene on the expression of NF - 魏B was observed .
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

【参考文献】