SOX2转录激活PD-L1在促进肝癌细胞增殖中的作用及其机制研究

发布时间：2018-06-25 07:15

  本文选题：肝细胞癌 + 性别决定区Y框蛋白2　； 参考：《南方医科大学》2017年博士论文

【摘要】：目的:探讨SOX2和PD-L1在肝癌中的表达、功能以及SOX2转录激活PD-L1在促进肝癌细胞增殖中的作用及其机制。方法:采用实时荧光定量核酸扩增实验、免疫印迹实验和免疫组化染色检测SOX2和PD-L1在肝癌组织和癌旁组织中的表达。采用实时荧光定量核酸扩增实验、免疫印迹实验和免疫荧光检测SOX2和PD-L1在三种肝癌细胞系和正常肝细胞系中的表达。利用siRNA的方法敲低SOX2在两种SOX2高表达肝癌细胞系中的表达,并比较在敲低SOX2基因前后这两种细胞系的增殖能力和细胞凋亡状态。通过实时荧光定量核酸扩增和免疫印迹实验验证SOX2在SOX2特定siRNA转染细胞的表达是否减少,利用CCK8和EdU染色评估SOX2缺失对细胞增殖的影响。使用TRANSFAC数据库研究PD-L1启动子区域内的转录因子SOX2结合位点,在转录起始位点上游-757bp处发现了一个一致性SOX2基序后,做关于包含启动子区域的SOX2基序的电泳迁移率实验和染色质免疫定量PCR实验来探讨SOX2是否直接通过SOX2基序结合到PD-L1的基因启动子区。利用荧光素酶报告基因实验进一步验证SOX2是否通过上述SOX2结合位点激活PD-L1的调节区域。结果:不论是在mRNA水平还是在蛋白质水平,SOX2和PD-L1在肝癌组织中的表达都显著高于癌旁组织,二者的mRNA表达水平呈正相关(r = 0.692)。SOX2和PD-L1在肝癌细胞系中的表达显著高于正常肝细胞系。利用siRNA的方法敲低SOX2在两种SOX2高表达肝癌细胞系中的表达,实时荧光定量核酸扩增检测和免疫印迹实验证实SOX2在SOX2特定siRNA转染细胞的表达减少。CCK8和EdU染色观察到肝癌细胞系HepG2和SMMC7721在转染了 siSOX2后,其细胞增殖显著减少,敲低SOX2基因也导致了肝癌细胞的凋亡。使用TRANSFAC数据库研究PD-L1启动子区域内的转录因子结合位点,在转录起始位点上游-757bp区域发现了一个一致性SOX2基序。包含启动子区域的SOX2基序的电泳迁移率实验和染色质免疫定量PCR实验发现当一个含有SOX2基序的22 bp的探针与从HepG2细胞系中提取出来的细胞核共孵育时,一个特别的DNA-蛋白质复合物出现了并且被抗SOX2抗体超迁移。这表明SOX2是直接通过SOX2基序结合到PD-L1的基因启动子区的,通过在肝癌HepG2细胞系中进行的染色质免疫定量PCR实验得到了进一步的验证。利用HEK-293T细胞进行了荧光素酶报告基因实验,克隆了包含SOX2基序和转录起始位点的PD-L1基因启动子到荧光素酶质粒中(pGL3-PD-L1),构建了一个pGL3-PD-L1突变质粒。SOX2基因共表达导致PD-L1基因启动子区显著激活,在当PD-L1启动子突变时,SOX2在PD-L1启动子区域的反式激活能力明显降低。结论:SOX2和PD-L1在肝癌组织及肝癌细胞系中的表达水平比癌旁组织和正常肝细胞系高,二者在肝癌组织中的表达呈正相关。在功能上,敲低SOX2可以降低肝癌细胞的活性,阻止肝癌细胞的生长和诱导肝癌细胞系的细胞凋亡。通过直接结合到位于PD-L1启动子区域的SOX2基序,SOX2调控PD-L1的表达并调节PD-L1基因启动子的活性。
[Abstract]:Objective : To investigate the expression of SOX2 and PD - L1 in hepatocellular carcinoma ( HCC ) and its mechanism by means of real - time fluorescence quantitative nucleic acid amplification , Western blot and immunohistochemical staining . The expression of SOX2 and PD - L1 in human hepatocellular carcinoma cell lines was significantly decreased . The expression of SOX2 in HCC cell line was reduced . The results showed that SOX2 was directly linked to the gene promoter region of PD - L1 by SOX2 motif . The results showed that SOX2 was directly linked to the promoter region of PD - L1 by SOX2 .
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

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本文编号：2065119