质谱在糖链结构鉴定和糖蛋白与抗体相互作用中的应用研究

发布时间：2018-06-25 08:43

  本文选题：质谱 + 人绒毛膜促性腺激素　； 参考：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：尽管现代科学已在癌症疾病的研究中取得了长足的进步,但它依然是人类最主要的致死因素。早期诊断对于癌症的治疗非常关键,它可以显著提高癌症的治疗效果和病人的存活率。癌症生物标志物通常是与疾病相关的特异性内源生物分子,通过监测其浓度可以获得疾病的相关信息,它们在癌症的早期诊断和治疗过程中发挥着非常重要的作用。癌症生物标志物通常用于癌症的筛查、诊断和疗效评价,同时也可以用于评估癌症病人的预后情况。FDA已批准用于癌症的诊断及给药后药物反应监测的生物标志物大部分是糖蛋白。糖蛋白是由寡糖链通过共价键连接至蛋白的多肽侧链而形成的,它们参与着许多关键的生物学过程。异常糖基化的蛋白在癌症的发病过程中扮演着非常关键的角色,它们中很多是癌症疾病的生物标志物。人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin, hCG)是一种非常重要的糖蛋白激素,主要由胎盘合体滋养层细胞合成。它是由α亚基和β亚基通过非共价的疏水和离子相互作用力结合而成的异二聚体。过糖基化hCG(Hyper-glycosylated hCG, hCG-H)是异常糖基化的hCG,其N-糖链由于发生了所谓的“过糖基化”,结构变得更加复杂。hCG-H主要由着床期的滋养层细胞和绒毛膜癌组织分泌,在多种生殖细胞肿瘤的侵袭和生长过程中发挥着重要作用,是一种重要的癌症生物标志物。如果在准确并快速测定hCG浓度的同时能够监测其N-糖链是否发生过糖基化,可增加相关癌症疾病的诊断的准确率和灵敏度。目前市面上虽然有多种针对hCG的免疫诊断产品,但并不能满足诊断需求,主要表现为：1)现有的免疫诊断产品通常基于一个假设,即hCG与抗体的结合能力不受其N-糖基化的影响,并未考虑N-糖基化的个体差异可能导致测定结果出现偏差。2)目前的诊断产品只局限于分析样品中hCG的含量,无法辨别病人的hCG的N-糖基化有无异常。要解决上述问题,关键是筛选到可以区分hCG与hCG-H的单克隆抗体。本论文的目标之一就是筛选出能够特异性辨别hCG与hCG-H的单克隆抗体,并采用质谱技术分析这些抗体与抗原相互作用的抗原表位,从抗原表位与糖链空间位置关系的角度阐明糖基化影响抗体亲和力的机理,为肿瘤糖蛋白生物标志物的抗体筛选提供重要理论依据,并为研发新一代hCG免疫诊断试剂盒奠定基础。低分子肝素是通过化学方法或酶法解聚肝素而制备的寡糖药物,在临床上主要用于防治深静脉血栓、肺动脉血栓等。近年来的研究表明低分子肝素还具有抑制恶性肿瘤细胞增殖、诱导恶性肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等活性,是一种非常具有潜力的抗肿瘤药物。低分子肝素的寡糖组分非常复杂,具有很强的异质性,结构表征对于其工艺优化、安全性评价及仿制药物申报都至关重要,建立一种灵敏并且高效的质谱分析方法具有非常重要的实用价值。本论文的另一重要目标是建立一种适用于低分子肝素的液相色谱与质谱联用分析方法。本论文的主要研究成果如下：1.建立了一种从生物样本中纯化hCG的方法我们将过滤、超滤与免疫亲和层析等方法结合,建立了一种从生物样品中纯化hCG的方法。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,从侵袭性葡萄胎病人尿液样品中纯化的hCG的条带更加弥散,表明该样品可能发生了过糖基化。胶内酶解和质谱鉴定的结果表明纯化的蛋白确为hCG。2.对hCG的糖基化位点及N-糖链组成进行了比较细致的分析用Trypsin将hCG酶切成肽段,然后用各种寡糖外切酶对O-糖链的糖单元进行逐个修剪,最终只保留一个GalNAc标签,然后对肽段样品进行nanoLC-MS/MS分析,我们首次发现a亚基的Thr-54也会发生O-糖基化。采用PNGase F分别释放hCG和hCG-H的N-糖链,样品经多孔石墨化碳(Porous graphitized carbon, PGC)固相萃取柱纯化后进行PGC-ESI-MS分析。我们发现hCG-H的多分支寡糖链(主要是四分支寡糖链)比例增加,表明从侵袭性葡萄胎尿液样本中纯化得到的hCG-H发生了过糖基化。3.筛选出受hCG糖基化状态影响和不受hCG糖基化状态影响的单克隆抗体采用生物膜光干涉技术(Bio-layer Interferometry, BLI)测定不同单克隆抗体与hCG和hCG-H的亲和解离常数(KD值)。我们发现MCA329与hCG和hCG-H的KD值接近,说明MCA329与hCG的结合不受抗原糖基化状态的影响；MCA1024与hCG的KD值远小于其与hCG-H的KD值,表明MCA1024与正常的hCG的结合力更强,其与hCG的结合受其糖基化状态的影响。4.采用氢／氘交换与质谱联用的方法分析hCG不同单克隆抗体的抗原表位采用氢/氘交换与质谱联用的方法分析MCA329和MCA1024与hCG相互作用的抗原表位。当hCGβ与MCA329结合后,β65-77、β78-83和β116-133这三条肽段氘的交换效率明显降低。hCGβ亚基C-末端肽段(β109-145)的缺失并不影响针对β2表位的抗体结合,这说明MCA329的抗原表位并不包含β116-133肽段。β116-133交换效率下降是因为MCA329从靠近C-末端肽段的方向与β65-83发卡结构的一端结合,限制了p116-133自由转动导致其交换效率下降。当hCGβ与MCA1024结合后,β65-77和β78-83这两条肽段氘的交换效率明显降低,说明MCA1024的抗原表位同样位于β65-83区域。MCA1024的亲和力受hCG的糖基化状态的影响,而3个N-糖基化位点(α亚基的Asn-52、β亚基的Asn-13和Asn-30)位于β65-83发卡结构另一端的两侧。位点特异性N-糖链分析结果表明：hCG-H中仅β亚基的Asn-13和Asn-30位点发生了明显的过糖基化,α亚基的Asn-52并未发生过糖基化。我们推测β亚基的Asn-13和Asn-30的过糖基化导致MCA1024的亲和力下降。我们采用PNGase F将hCG-H部分脱N-糖链后,MCA1024的亲和力提高,这一结果证明了我们的推断。5.建立了一种低分子肝素完整糖链的质谱分析方法我们建立了一种低分子肝素完整糖链的反相离子对色谱与高分辨质谱联用(Reversed phase ion pair electrospray ionization mass spectrometry, RPIP-ESI-MS)分析方法,采用该方法不仅可以获得低分子肝素样品的高分离度TIC指纹谱图,还能对样品中的各种寡糖组分进行分析。结合我们开发的半自动谱图解析软件,分别可以从依诺肝素和那曲肝素中鉴定到从四糖至二十六糖的140多种和80种组分,各组分的误差均在20 ppm以内。此外,该方法还可用于样品中微量杂质的鉴定。
[Abstract]:Although modern science has made considerable progress in the study of cancer , it is still the main lethal factor for cancer . Early diagnosis is crucial for cancer treatment . It plays a very important role in the early diagnosis and treatment of cancer . Cancer biomarkers are usually used for cancer screening , diagnosis and efficacy evaluation , and are also useful for assessing the prognosis of cancer patients . In recent years , it has been shown that low molecular weight heparin can inhibit the proliferation of malignant tumor cells , induce malignant tumor cell apoptosis and inhibit tumor angiogenesis .
The exchange efficiency of 尾 65 - 77 , 尾 78 - 83 and 尾 116 - 133 was significantly lower than that of 尾 65 - 83 . When hCG 尾 was combined with MCA1024 , 尾 65 - 77 , Asn - 13 and Asn - 30 of 尾 - subunit were not affected by glycosylation .
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.43
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本文编号：2065346