长链非编码RNA MALAT1在骨肉痛临床预后中的作用分析及相关调控研究

发布时间：2018-07-04 20:38

本文选题：骨肉瘤 + 长链非编码RNA　；参考：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：目的分别检测骨肉瘤组织与临近非肿瘤组织,骨肉瘤患者血清和健康体检人群血清长链非编码RNA MALATl的表达水平,并对其表达水平和骨肉瘤患者的临床特征之间的关系,在诊断,预后中的中的价值进行分析。在此基础上,我们进一步检测了MALAT1在骨肉瘤细胞系中的表达水平,并分析MALAT1在骨肉瘤细胞增殖,凋亡和迁移,侵袭中的作用及对钙黏蛋白和miR-205的调控,从而揭示MALAT1在骨肉瘤疾病发生发展中的作用。方法1.共收集66例骨肉瘤组织及临近非肿瘤骨组织,45例骨肉瘤患者血清及30例正常体检人群的血清样本。运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测MALAT1及其他相关分子的表达水平。2.通过绘制ROC曲线及术后跟踪调查来对MALAT1在骨肉瘤患者中的诊断和预后价值进行分析。3.共使用U20S, MG63, SAOS-2和SOSP-9607四种骨肉瘤细胞系,和一种正常成骨细胞系hFOB作为对照。运RT-qPCR方法检测上述细胞MALAT1及其他相关分子的表达水平。4.采用脂质体转染的方法对上述细胞系进行MALAT1及其他相关分子高表达和沉默处理,处理之后进行后续的功能试验或RNA和蛋白水平检测。5.通过CCK8方法对骨肉瘤细胞系的增殖能力进行评估,通过流式凋亡细胞术对骨肉瘤细胞系的凋亡情况进行评估,通过运用transwell小室实验对骨肉瘤细胞系的迁移侵袭能力进行检测；运用RNA免疫共沉淀(RIP)和DNA免疫共沉淀(CMP)方法对MALAT1与EZH2, EZH2与钙黏蛋白之间的交联进行分析；运用western blot方法或免疫荧光方法对本研究中的蛋白表达水平进行检测。结果1.四种骨肉瘤细胞系U20S, MG63, SAOS-2和SOSP-9607的MALAT1表达水平显著高于正常成骨细胞系hFOB的表达水平；66例骨肉瘤患者肿瘤组织的MALAT1表达水平显著高于相邻正常骨组织表达水平,而且58.8%的患者的MALAT1表达水平高于相邻正常骨组织的表达的两倍水平。临床特征分析发现骨肉瘤组织的MALAT1表达水平与患者肿瘤侵袭(T),淋巴结转移(N)和远处转移(M)显著相关。三期和四期的骨肉瘤患者的表达水平显著高于一期和二期患者。高表达MALAT1的临床骨肉瘤患者其总体生存时间和无病生存时间显著短于低表达的患者。2. RT-qPCR发现MALAT1和E-cadherin的mRNA表达水平在骨肉瘤组织中呈显著负相关。Transwelll小室实验提示MALAT1能够显著提高骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力,并且能够显著降低E-cadherin蛋白的表达水平并促进Vimentin蛋白的表达。CCK8实验发现MALAT1能够显著提高骨肉瘤细胞的增殖能力。3. RT-qPCR结果证明EZH2 mRNA表达水平在骨肉瘤组织中显著升高,在骨肉瘤细胞系中也显著升高,并且相关性分析发现MALAT1和EZH2表达水平呈显著正相关。RIP实验发现EZH2中MALAT1富集显著,进一步分段RT-qPCR发现MALAT1的3’端与EZH2相交联。4.EZH2能够负向调控E-cadhein的表达,并且染色体免疫共沉淀实验(ChIP)证实E-cadherin与EZH2相交联,从而抑制E-cadherin的表达。进一步研究发现MALAT1下调能够显著降低E-cadherin与EZH2的交联作用,从而说明MALAT1通过与EZH2相结合作用的方式抑制E-cadherin的表达。并且功能试验发现si-EZH2沉默EZH2之后能够显著逆转MALAT1对细胞迁移侵袭能力及EMT能力的影响。5.通过miRcode生物信息学分析,我们证明了MALAT1与miR-205有结合区域,而且MALAT1和miR-205能够相互抑制对方的表达水平,而且功能试验发现miR-205能够显著抑制MALAT1引起的细胞增殖能力的提高。从而揭示了MALAT1对细胞增殖能力影响是通过miR-205起作用。结论MALAT1在骨肉瘤组织中高表达并且肿瘤转移密切相关,高表达MALAT1的患者其生存能力显著降低,说明MALAT1可作为骨肉瘤患者临床预后的重要因子。相关功能试验发现MALAT1能够显著提高骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力,并能促进骨肉瘤细胞的增殖,这是通过与EZH2相关联从而进一步降低E-cadherin的表达水平来实现的。最后,我们还发现MALAT1与miR-205相互抑制,miR-205能够显著逆转MALAT1所导致的升高的增殖能力。总之,我们揭示了MALAT1作为一个长链非编码RNA在骨肉瘤中的预后价值和潜在功能作用机制,为临床提高骨肉瘤患者的治疗和预后具有重要的价值,通过抑制MALAT1的表达可作为临床骨肉瘤患者的治疗和提高患者预后的有效方案。
[Abstract]:Objective To investigate the expression level of MALAT1 in osteosarcoma cell line by means of real - time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ( RT - qPCR ) .
The cross - linking between MALAT and EZH2 , EZH2 and cadherin was analyzed by means of RNA immune coprecipitation ( RIP ) and DNA immunization co - precipitation ( CMP ) method .
The expression level of MALAT was significantly higher than that of normal osteoblast - line hFOB by western blot or immunofluorescence assay . Results 1 . The expression level of MALAT1 in four osteosarcoma cell lines U20, MG63 , SAOS - 2 and SOSP - 9607 was significantly higher than that of normal osteoblast - line hFOB .
The malAT1 expression level of 66 patients with osteosarcoma was significantly higher than that of adjacent normal bone tissues , and 58.8 % of patients with osteosarcoma were significantly higher than those of adjacent normal bone tissues . The clinical feature analysis found that the level of MALAT expression in osteosarcoma was significantly correlated with the invasion of tumor ( T ) , lymph node metastasis ( N ) and distant metastasis ( M ) . The expression level of MALAT and E - cadherin was negatively correlated with the expression of malAT1 and E - cadherin in osteosarcoma . Conclusion MALAT2 can significantly reduce the expression of MALAT and EZH2 . Conclusion MALAT1 can significantly reduce the expression level of MALAT and EZH2 , and it is shown that MALAT can significantly reduce the expression level of MALAT and EZH2 .
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R738.1

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