2015微流控芯片技术在循环肿瘤细胞分离中的研究进展

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生物化学与生物物理进展

ProgressinBiochemistryandBiophysics2015,42(4):301~312

微流控芯片技术在循环肿瘤细胞

分离中的研究进展*

吕晓庆1)李

雷2)**陈红梅3)陈鹏4)**刘静2)

移的必要前提[1-2]．微环境改变的条件下，CTCs又发生间质-上皮转化(mesenchymal-epithelialtransition，MET)而在远端器官中停留，生成新的肿瘤，从而导致肿瘤转移[3]．CTCs检测在新的肿瘤生物标志物的发现、肿瘤预后判断及个体化治疗方面存在很大的应用潜力，是国内外肿瘤研究的热点之一．然而，CTCs在血液中的数量非常少，109个血细胞中仅含有1～10个CTCs[4]，因此，CTCs研究的关键在于从含有大量血细胞的复杂血液样本中准确、高效地将其分选出来[5]，满足高捕获率、高纯度和高通量的要求，进而成为能够满足科研和临床需求的工具．a．高捕获率，即可以将样品中的CTCs尽可能多地分离出来；b．高纯度，

它是一个依赖于免疫磁珠原理的半自动化工作系统．该系统通过连接了抗上皮细胞黏附分子抗体(epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM)的磁珠和CTCs表面标志物EpCAM特异性结合，达到捕获CTCs的目的．CTCs的识别使用经典的免疫染色法．该系统分选CTCs效率为80%[6]．尽管

*中国科学院重点部署项目(KJZD-EW-TZ-L03-6)，天津市自然科学基金项目(13JCYBJC23600)，国家自然科学基金面上项目(61078074)和中国博士后科学基金(2014M550794)资助.**通讯联系人.

李雷.Tel:010-82543766,E-mail:lileilei@mail.ipc.ac.cn陈鹏.Tel:022-23340123,E-mail:chenpengdoc@sina.com收稿日期：2015-02-02，接受日期：2015-03-05

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CellSearch已通过FDA批准，但该系统还存在一些缺点，比如暂未实现全自动分选、假阳性比率高[7]、富集后的CTCs没有生物活性等，更重要的是，CellSearch捕获到的CTCs仅仅是EpCAM阳性的类型，而许多恶性程度很高的CTCs并不表达EpCAM，从而无法被检测出来．

微流控芯片是一个集样品制备、反应、分离、检测等功能于一体的小型分析实验平台，它通过微加工技术，在硅、玻璃、聚二甲基硅氧烷

需求，制作出进行实验．将工作简化到试剂的消耗灵敏度和分析随断扩展，分析为一测[10-11]、细胞显示出巨大的应用潜力．由于微流控芯片管道尺寸在微米量级和细胞尺寸匹配，非常适合应用于细胞分选，近些年来，有越来越多的研究者将该技术应用在CTCs的分选上．

微流控芯片分选和富集CTCs的原理主要分为4类：a．利用抗原抗体亲和性进行分选；b．利用细胞物理特征的不同进行分选，比如细胞大小、变形性以及不同大小的细胞在流场中的力学特性；c．利用免疫磁珠具有磁性兼连接抗体的作用进行差异进行分选总结了近年的研究现状和原理进行细胞方法之一道或微结构特异性抗体

(a)A

B(b)C

血液

E

间距不等的微柱

D

过滤

确定性侧向位移

Fig.1TheschematicofvariousCTCscapturingmicrofluidicchips图1

微流控芯片捕获CTCs各类芯片结构示意图

(a)亲和性分选法(A:亲和性分选芯片原理示意图;B:亲和性分选芯片系统装置及芯片内部微柱显微照片).(b)物理特征分选法(C:大小-变形性分选微柱捕获示意图;D:大小-变形性分选微孔捕获示意图;E:确定性侧向位移芯片示意图).(c)免疫磁珠分选法(F:免疫磁珠捕获原理示意图;G:磁珠和大小-变形性方法结合捕获示意图，细胞与磁珠结合后，尺寸增加，更有利于细胞被捕获).(d)双向电泳分选法示意图.

2015;42(4)吕晓庆,等：微流控芯片技术在循环肿瘤细胞分离中的研究进展

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或适配体，比如上皮细胞黏附分子，当样品流经微

通道时，目的细胞表面抗原与微通道或微结构上的特异性抗体或适配体结合，细胞被固定在芯片内，其他细胞随缓冲液流出芯片；再用合适的方法，比如更换缓冲液，洗脱并收集目的细胞进行下游分析.

He等[14]设计了一种由TiO2纳米颗粒制备的具有生物相容性纳米薄膜，在玻璃基底中旋涂这种纳米薄膜，再在薄膜上修饰EpCAM抗体，样品通过芯片时，CTCs结合在纳米薄膜上而留在芯片中．该研究将人结肠癌细胞HCT116混入健康人血液作为待测样品，成功分离出HCT116细胞，其效率约为80%．这种由纳米颗粒组成的纳米薄膜可以增加抗体和细胞表面抗原之间的接触机率．通过加大流体剪切力可将约50%的被捕获细胞洗脱下来，洗脱下来的细胞具有生物活性，可进行体外培养．Sheng等[15]制作了几何增强混合(geometricallyenhancedmixing)芯片，简称“GEMchip”，大小与载玻片相同，芯片中有很多鱼脊形或形结构，8个并联管道用以加大通量．这内部的鱼脊形或V形结构形成涡流高胞与抗体之间的接触机率，有利于目的细胞与芯片结构内修饰的抗体结合，，从而高效捕获CTCs．该研究将人胰腺癌细胞混入健康人血液作为待测样品进行实验，捕获效率高达90%，同样，被捕获的肿瘤细胞可以被洗脱并继续培养进行后续实验．Launiere等[16]设计了一种内部连接EpCAM和E选择素(E-selectin)的双抗体芯片，E选择素用于加大肿瘤细胞在所受流体剪切力作用下的捕获效率，与其结合的白细胞可以用一种螯合钙的缓冲液洗脱下来，肿瘤细胞则留在芯片内．文中还用只修饰EpCAM抗作为对比，证明这种方法的捕获效率是抗体的芯片捕获效率的1.9计了具有微柱阵列结构系EpCAM表平系NCI-H165的悬液99%，对于116例肿瘤转(包括胰腺癌、乳腺癌和结肠癌)到了数量不等的CTCs．其捕获CTCs的微流控芯片整理列捕获单元

TiO2纳米颗粒纳鱼脊形或V形直线微柱PDMS鱼骨曲线PMMA微管道金纳米孔PMMA微管道纳米多孔聚碳酸酯膜

硅纳米柱子

-：文章中未提．

tocaptureCTCs

CTCs文献总结

样品

HCT116细胞混于血液L3.6pl细胞混于血液MCF-7细胞PBS悬液

NCI-H165细胞PBS悬液，癌症病人血液

PC-3细胞混于血液15例转移性前列腺癌病人血液

MCF-7细胞混于血液中PANC-1细胞混于血液PC-3细胞混于白细胞MCF-7、PC-3、T-26细胞混于血液

26例前列腺癌病人血液

捕获效率/%

8090959991.897-7095

参考文献[14][15][16][17][18][19][20][21][22]

表Anti-EpCAMAnti-EpCAMAnti-EpCAMAnti-EpCAM

亲和性分选法有特异性高的优点，能有效分选形状、大小相似的不同种类细胞．目前大部分研究者采用EpCAM作为CTCs的表面特异性抗原[14-22]，但是在不同的肿瘤亚型中，EpCAM的表达各不相同，例如乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231的EpCAM表达水平不同[23]，并且当肿瘤细胞通过上

皮间质转化(EMT)作用传播时，EpCAM和角蛋白(CKs)的表达下调，波形蛋白(vimentin)和N-钙黏素(N-cardherin)表达上调[24]．依赖EpCAM的CTCs分选芯片会丢失不表达或低表达EpCAM的CTCs，然而这些CTCs具有更大的浸润性和侵入性[25]．因此，缺乏公认的表面标志物限制了亲和性分选在

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CTCs分选中的应用．另外，亲和性分选法要在通量和效率之间权衡，流速越大，CTCs和抗体反应的时间越少，这会导致分选效率降低．亲和性分选法与大小变形性分选法相结合，或使用多抗体修饰的芯片分选CTCs也许是个不错的解决办法，但不同种类抗体的反应缓冲液以及反应条件各不相同，实验成本也会随之增加．因此，增加芯片内部结构与细胞接触的面积和机率，在芯片内部修饰多种抗体捕获不同蛋白质表达的CTCs，是利用亲和性分选法原理分离CTCs的微流控芯片发展的主要方向．另外这种方法非常适合分选已知表面抗原的目的细胞，比如血液中的一些免疫细胞等．

Hosokawa等[29]则用微腔阵列(microcavityarray，MCA)系统捕获CTCs，该系统的核心结构由100伊100个8～9滋m直径的圆孔阵列组成，芯片下面连接蠕动泵．实验中，NCI-H358细胞混在血液中，蠕动泵将样品从蓄液池吸入芯片，血细胞通过圆孔随缓冲液流出，肿瘤细胞则由于负压作用被固定在圆孔上从而被成功分离．该系统可将混在1ml血液中的10个肿瘤细胞在15min内完全捕获，并且保持细胞活性．染色鉴别结果证明其分选效率高达97%，大大同一实验样本采用CellSearch系统的等[30]设计了一种不同间距的“棘齿”型微，间距依次从18滋m到2滋m样品呈振荡流，与垂直方向流速，肿瘤细胞和膀胱癌细胞掺在健康在70%以上．Lv等[31]设计种间距，该芯片结构分为过两过滤部分的作用是滤掉血液中大限度减少芯片堵塞；捕获部分则设计微柱，间距从12滋m到4滋m递减，血过微柱，而肿瘤细胞则被捕获，肿瘤细胞酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，PBS)液样品的捕获效率高达90%以上．其他基于细胞大小和变形性差异原理捕获循环肿瘤细胞的微流控芯片整理列于表2．

基于细胞大小和变形性差异分选法捕获CTCs的优势在于：a．操作过程简单，样品只需用缓冲液稀释，不需要进行染色标记，检测时直接将稀释后的全血通入芯片，在出口处收集细胞即可；b．捕获效率高；c．能够实现高通量分选；d．成本远远低于CellSearch；e．无需依赖表面标志物，分选出的CTCs可以用多种抗体进行标志物鉴别．该方法存在的问题是仅仅基于细胞尺寸和变形性不同而进行过滤式分选，由于CTCs尺寸和白细胞有重叠部分，CTCs有可能会通过滤网或微柱的间隔，然而这些CTCs由于经历了EMT作用而具有间质细胞特性，更容易发生转移，恶性程度更高[32]；而且在较大的机械力作用下，CTCs随着缓冲液流过微柱或者滤网时容易破裂[33]．这些因素会对分离纯度和细胞活性造成一定影响，这类芯片在设计内部捕获单元时应避免使用带棱角的微柱，比如三角形、长方形、正方形等，而改用圆形、椭圆形等微柱，减少对细胞的损伤．

2物理特征分选

微流控芯片进行CTCs分选，常根据CTCs与血细胞物理特性(如变形性、大小、流体力学特性等)的差异，通过在芯片中设置不同的微结构将其从血液中分离出来，常用的微结构包括、微过滤网和微柱等．

2援1基于细胞大小和变形性差异

大多数上皮来源的CTCs直径不等，而白细胞直径从8～20滋．片内部设计不同的小于径、微网、微柱等结构(图1b(C品流经芯片时，卡内，血细胞则随液流被结构捕获时，由于小，加大缓冲液流速时，被CTCs则留在芯片内，从而达到分离Abnova公司的CXSystem[27]就是基于此原理分离CTCs的代，该系统还可以动态监测CTCs的捕获过程．芯片主要结构由圆柱形微柱构成，每个捕获单元由三个圆柱排列组成一个“爪形”结构．捕获后的CTCs可以进行染色鉴别和计数，亦可被重新收集继续培养进行后续实验，如研究CTCs的分子生物学特征、建立动物模型、临床个体病例研究等．

Lim等[28]设计了一种微筛芯片，该芯片由硅片加工而成，其捕获单元为包含105个小孔的微阵列，蠕动泵将血液样品从芯片上方泵入进行捕获．该系统捕获掺在健康人血液中的MCF-7和HepG2细胞的效率在80%以上．该作者又用8例癌症病人血液样品进一步验证了该系统的可靠性，成功从病人血液中分离出CTCs，整个处理过程仅需1.5h.

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