ISET联合细胞免疫荧光检测循环肿瘤细胞技术体系的建立及其临床研究

发布时间：2018-10-04 19:59

【摘要】：背景外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)存在于多种恶性肿瘤中,其检测对于肿瘤早期诊断、预后分析、疗效检测以及个体化治疗等众多方面具有重要的临床意义,并因能够实时检测、创伤小等优点成为备受关注的“液态活检”。目前CTCs检测的主要方法包括依赖肿瘤相关标志物检测的Cell Search系统及基于形态学富集的膜过滤技术(Isolating by size of epithelial tumor cells,ISET)。前者是基于细胞表面表达不同抗原标志,将针对肿瘤细胞表面抗原的特异性抗体EpCAM、CK等包被于磁珠表面以完成肿瘤细胞的特异性识别,借助外加磁场筛选富集CTCs。该技术的优势在于特异度较高,已有商品化的半自动检测设备；但肿瘤特异性抗原表达的缺失会造成假阴性结果。后者是根据细胞大小的差异,利用过滤的方法将体积较大的肿瘤细胞筛选富集。该技术的优势在于方法简单、价格低廉,分离获得的CTCs具有活性可用于后续研究；但由于缺乏形态学诊断金标准,该富集技术特异性相对较差。我们课题组基于ISET原理,通过前期研究建立了改良ISET检测CTCs技术体系,主要工作基础包括：建立了改良ISET手工实验装置、改良了染色方法、提高了肿瘤细胞截留率,研究结果表明该技术体系检测效果较为理想,肿瘤细胞截留率可达80%以上,染色后的细胞形态学结构可辨,能区分典型的CTCs与正常白细胞。但该技术体系仍然存在不足,首先是形态学标准的缺乏致使CTCs的鉴定易受人为主观因素影响,其次是过滤过程中时有堵孔现象出现,致血样过滤缓慢或不顺畅。目的通过对前期建立的改良ISET检测循环肿瘤细胞技术体系进行优化,联合细胞免疫荧光技术,建立一种新的检测循环肿瘤细胞的可靠方法；通过与CTC-Bi opsy、CellSearch两种方法对比,验证ISET联合细胞免疫荧光技术检测多种晚期肿瘤患者外周血中的循环肿瘤细胞的检测效果,探讨其临床应用价值。方法1.对课题组前期建立的改良ISET检测循环肿瘤细胞技术体系进行两处优化,即血样预处理过程增加“红细胞裂解”操作过程、增大滤膜孔径。2.联合细胞免疫荧光技术,建立ISET联合细胞免疫荧光检测循环肿瘤细胞技术体系,并通过检测23侈Ⅲ/Ⅳ期肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞进行临床预研究。3.建立ISET联合细胞蜡块免疫组化技术体系,以上皮间质转化标志物Twist、 Vimentin、E-Cadherin为检测指标验证上述23例临床样本中是否存在EMT现象。4.运用ISET联合细胞免疫荧光技术体系检测肺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、肾癌、肝癌共计74例患者外周血循环肿瘤细胞,通过与CTC-Biopsy、 CellSearch两种方法对比,探讨其临床应用可行性。结 果1.对课题组前期建立的改良ISET检测循环肿瘤细胞技术体系进行两处优化后,新技术体系过滤更顺畅,染色更清晰可辨,肿瘤细胞截留率无明显减低。2.通过联合细胞免疫荧光技术,建立了ISET联合细胞免疫荧光检测循环肿瘤细胞技术体系。对23例Ⅲ-Ⅳ期肿瘤患者进行外周血循环肿瘤细胞检测,发现CTCs阳性9例(9/23,39.1%),EMT-CTCs阳性3例(3/23,13.0%),CTM3例(3/23,13.0%)。3.建立了ISET联合细胞蜡块免疫组化技术体系,对上述23例临床样本中检测到的EMT进行验证,发现Twist抗原表达阳性1例,Vimentin抗原表达阳性2例。4.通过检测74例肺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、肾癌、肝癌患者外周血循环肿瘤细胞,发现ISET联合细胞免疫荧光技术总体阳性检出率(13/74,17.6%)介于CellSearch(9/74,12.2%)与CTC-Biopsy(14/74,18.9%)之间。进一步对比分析,ISET联合细胞免疫荧光方法与CellSearch方法CTCs总体阳性检出率有显著性差异(χ2=10.21,p=0.007),前者检出率高于后者。ISET联合细胞免疫荧光方法与CTC-Biopsy方法CTCs总体阳性检出率无显著性差异(χ2=3.926,p=0.062),但两者一致性较差(Kappa=0.230)。结论1.通过对课题组前期ISET技术进行优化,联合细胞免疫荧光技术,建立了ISET-ICC检测CTCs技术体系。2.通过细胞蜡块-免疫组化技术体系,验证了ISET-ICC技术体系分离获得的CTCs性质,证实了EMT的存在。3.通过与CellSearch、CTC-Biopsy两种CTCs检测方法对比,证实了ISET-ICC技术具有临床应用可行性,能够用于肺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、肾癌、肝癌患者的CTCs检测。4.ISET联合细胞免疫荧光技术能检测到上皮间质转化的循环肿瘤细胞以及循环肿瘤微栓,而这两种细胞是造成CellSearch假阴性的主要原因。5.ISET联合细胞免疫荧光技术能够辅助鉴定CTC-Biopsy方法富集的CTCs。
[Abstract]:Background Peripheral blood circulating tumor cells (CTCs) are present in many malignant tumors, and their detection has important clinical significance in many aspects such as early diagnosis, prognosis analysis, curative effect detection and individualized treatment, and can be detected in real time, The advantages of small wound and so on become the most important 鈥渓iquid biopsy鈥，

本文编号：2251683