【摘要】：研究背景:肺癌是全球发病率和死亡率排在首位的癌症,其中占绝大部分(85%)类型是非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)。第一代可逆性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs),其中最为人熟知的两种药物为厄洛替尼(erlotinib)和易瑞沙(gefitinib),在含有EGFR活性突变的NSCLC患者中,取得了可喜的疗效,但敏感突变患者中亦有20%-30%对EGFR-TKIs原发性耐药,EGFR-TKIs原发性耐药在很大程度上限制了其在临床上的应用。因此,如果能发现克服TKIs原发性耐药的有效治疗措施,对于提高疗效,减轻药物毒副反应,改善患者预后具有非常重要的科学意义和临床价值。我们研究团队前期完成的基础研究发现,二甲双胍可以通过下调IL-6/STAT3信号途径,进而克服获得性耐药NSCLC细胞和裸鼠移植瘤对厄洛替尼和吉非替尼的耐药,IL-6/STAT3信号通路是可逆性EGFR-TKIs产生获得性耐药的重要机制,二甲双胍可以作用于该信号途径从而发挥克服耐药的作用。后续我们发现,在原发性耐药肺癌细胞中,p-STAT3较敏感细胞表达量无明显差异,IL-6/STAT3信号途径在原发性耐药机制中并不重要。而有研究发现,首次接受EGFR-TKIs治疗迅速出现疾病进展的肺癌患者,取其肿瘤活组织进行免疫组织细胞学检测发现存在IGF-1R高表达的情况;我们也发现原发性耐药H1975(L858R/T790M)肺癌细胞较敏感细胞相比,p-IGF1R水平显著升高。而抑制IGF-1R活化可以克服H1975细胞对EGFR-TKIs的耐药。因此,IGF-1R信号途径参与了EGFR-TKIs原发性耐药的发生和发展,其可能是导致原发耐药的重要机制。二甲双胍,老式的降糖药物,具有安全性好和价格低廉的优势。越来越多的研究报道,二甲双胍可以延缓体内肿瘤的进展和杀伤体外癌细胞的增殖。令人感到有趣的是,二甲双胍阻遏体外肿瘤细胞生长的机制与抑制IGF-1R信号通路活化有关。因此,二甲双胍有望与EGFR-TKIs联用,通过抑制IGF-1R信号通路的激活,达到克服原发性耐药的目的。但这种联合用药模式所产生的效应尚且需要验证,具体相关机制仍未得到阐明和验证。本研究进一步证实二甲双胍联合吉非替尼克服原发性耐药的效应,阐明相关机制。目的:对于基因检测出含有EGFR敏感突变的NSCLC患者使用一代EGFR-TKIs,如吉非替尼或者厄洛替尼,能够显示出相当好的临床获益率。但是,有20%-30%检测出活性突变的肺癌患者对可逆性EGFR-TKIs原发性耐药。已有研究报道,EMT进程参与了EGFR-TKIs原发性耐药的发生发展,同时靶向EGFR和IGF-1R有望克服原发性耐药。本研究进一步探讨IGF-1R信号通路以及EMT在de novo T790M突变所致EGFR-TKIs原发性耐药中所扮演角色的重要性;二甲双胍是否能够增效可逆性EGFR-TKIs抗原发性耐药的作用,其增效机制是否与阻断IGF-1R信号通路和逆转EMT转变有关。方法:本研究主要通过MTT、BrdU、克隆形成实验、侵袭实验、迁移实验、流式细胞凋亡检测、免疫荧光、Western blot、RNA干扰等实验方法检测在de novo T790M突变所致原发性耐药NSCLC细胞中,抑制IGF-1R信号通路以及逆转EMT对可逆性EGFR-TKIs的协同增效作用;二甲双胍在体外通过阻断IGF-1R信号通路和逆转EMT对可逆性EGFR-TKIs的协同抑制作用。结果:1.对比EGFR-TKIs获得性耐药肺癌细胞(PC-9GR,H1650-M3)以及EGFR-TKIs敏感肺癌细胞(PC-9,HCC827),原发性耐药肺癌H1975细胞的IGF1-R磷酸化蛋白水平明显增加;对比EGFR-TKIs敏感肺癌细胞(PC-9,HCC827),EGFR-TKIs原发性耐药肺癌H1975细胞的上皮细胞相关蛋白降低,间质相关蛋白升高,即发生了EMT表型的变化。2.下调IGF-1R的活性或者干扰IGF-1R RNA表达能够有效增加吉非替尼抑制H1975细胞的增殖活性以及诱导H1975细胞的凋亡效应,其机制是通过抑制下游AKT活化、激活促凋亡蛋白BIM以及促进间质上皮样转化。3.本研究证实了二甲双胍作为被广泛应用的抗糖尿病药物,在体外联合吉非替尼可以有效地协同抑制EGFR-TKIs原发性耐药肺癌H1975细胞的增殖、侵袭、转移和诱导凋亡。其协同增效机制是通过抑制IGF-1R信号通路的激活以及逆转EMT进程。结论:我们研究发现:IGF-1R信号轴和上皮向间质样的转变在EGFR-TKIs原发性耐药中扮演着至关重要的角色。二甲双胍联用EGFR-TKIs是克服原发性耐药的经济、安全、有效联合用药模式,其作用机制是通过抑制IGF-1R信号轴的激活以及逆转EMT进程。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2
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