白介素18对胰腺癌免疫治疗作用及其机制的研究

发布时间：2019-01-20 14:27

【摘要】：第一部分IL-18在胰腺癌组织及胰腺癌患者血浆中表达的检测目的：筛选胰腺癌潜在的免疫治疗因子,并扩大样本量在胰腺癌组织和胰腺癌患者血浆中进行检测。方法：采用RayBiotech Human Cytokine Array分析3例胰腺癌及健康对照血浆中差异表达的细胞因子,结合本实验组胰腺癌表达谱基因芯片数据,初步确定研究对象；E-LISA检测104例胰腺癌患者、35例胰腺良性肿瘤患者、27例十二指肠肿瘤患者、77例胆管癌患者、8例肝癌患者、22例胰腺炎患者、38例健康对照血浆中IL-18的表达,并分析IL-18表达量与胰腺癌预后的关系；免疫组织化学检测112例胰腺癌及相应癌旁正常胰腺组织中IL-18的表达,并分析IL-18表达量与临床病理、临床分期以及预后的关系。结果： 1. Ray Biotech Human Cytokine Array示差异性表达细胞因子23个,其中胰腺癌患者血浆中高表达11个、低表达12个,在高表达的细胞因子中,IL-18差异最明显;胰腺癌组织基因芯片数据分析显示IL-18在胰腺癌与免疫系统的相互作用中可能发挥重要作用。 2.IL-18在胰腺癌患者血浆中的表达量相对胰腺良性肿瘤、十二指肠肿瘤、胆管癌、肝癌、胰腺炎患者高表达；在胰腺癌患者中,手术前3天IL-18的表达量要比手术后3天的高(p0.01)；IL-18的表达量与胰腺癌生存期呈正相关(p0.05)。 3.IL-18在胰腺癌组织中相对应癌旁正常胰腺组织呈明显的高表达(p0.001),且IL-18的表达量与是否发生侵袭转移(p0.05)和AJCC临床分期密切相关；IL-18在胰腺癌组织中的表达量与生存期呈负相关(p0.001)。结论： 1. IL-18可能在胰腺癌与免疫系统的相互作用中发挥重要作用,可以作为进一步的研究对象。 2.IL-18在胰腺癌患者血浆中高表达,且与生存期呈正相关；IL-18在胰腺癌组织中高表达,且与生存期呈负相关。第二部分单用IL-18对胰腺癌免疫治疗作用的研究目的：明确IL-18对常见免疫细胞亚群的影响,并确定重组IL-18对免疫功能正常和免疫缺陷的胰腺癌原位移植小鼠生存时间的影响。方法： 1.分离健康志愿者PBMC,体外培养,IL-18干预后,CCK-8检测PBMC增殖情况,流式细胞术检测常见免疫细胞亚群的比例变化。 2.C57BL/6J鼠腹腔注射重组鼠IL-18一周,分离脾脏和腹腔淋巴结免疫细胞,流式细胞术检测常见免疫细胞亚群比例的变化。 3.构建IL-18-/C57BL/6J鼠,分离脾脏和腹腔淋巴结免疫细胞,流式细胞术检测常见免疫细胞亚群比例的变化。 4.筛选8周大C57BL/6J鼠和Balb/c裸鼠,采用鼠胰腺癌细胞系LTPA构建胰腺癌原位移植模型,鼠重组IL-18干预,监测小鼠生长状态和生存时间。结果： 1.IL-18可以促进PBMC的增殖(p0.05),显著增加Tc细胞(p0.001)和NK细胞(p0.05)细胞的比例。 2.IL-18显著增加小鼠脾脏和淋巴结中Tc细胞和NK细胞的比例,结果具有统计学意义。 3.相对于野生型C57BL/6J小鼠,IL-18基因敲出鼠脾脏和淋巴结中的Tc细胞(p0.05)和NK细胞(p0.05)细胞比例显著下降。 4.在C57BL/6J鼠胰腺癌原位移植模型中,IL-18对小鼠体重增长曲线和生存曲线无影响;在Balb/c裸鼠胰腺癌原位移植模型中,IL-18干预组小鼠生存时间缩短(p0.01),更早开始出现体重下降等恶病质表现。结论： 1.IL-18在体内外实验中上调Tc细胞和NK细胞的比例。 2.在免疫功能正常的C57BL/6J小鼠胰腺癌原位移植模型中,单用重组IL-18并不能起到治疗的作用；在免疫缺陷的Balb/c裸鼠胰腺癌原位移植模型中,重组IL-18干预反而促进肿瘤的发展,缩短荷瘤小鼠生存时间。第三部分IL-18对胰腺癌增殖侵袭转移的影响及其机制的研究目的：研究IL-18在体内外对胰腺癌增殖和侵袭转移的影响并探讨其机制方法： 1.构建IL-18过表达、沉默慢病毒载体,转染人胰腺癌细胞系panc-1和mia-paca-2ψCCK-8实验、胰腺癌3D培养模型、transwell实验及划痕实验检测IL-18在体外对胰腺癌增殖、侵袭转移的影响。人重组IL-18干预panc-1和mia-paca-2后,CCK-8实验、胰腺癌3D培养模型,transwell实验检测IL-18在体外对胰腺癌增殖、侵袭转移的影响。 2.构建Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型和胰腺癌Balb/c裸鼠脾脏种植肝转移模型,监测裸鼠移植瘤增长情况和体重增长情况,利用肝脏病理切片检测其对胰腺癌体内远处转移能力的影响。 3.基因芯片数据分析IL-18影响胰腺癌增殖和侵袭转移的可能机制；western blot、 EMSA、双荧光报告素酶实验、免疫荧光实验验证IL-18是否激活NF-κB信号通路；CCK-8实验、transwell实验验证IL-18是否通过NF-κB信号通路影响胰腺癌的增殖和侵袭转移；real-time PCR、ChIP、western blot实验确定IL-18激活NF-κB信号通路后的靶基因。结果： 1.上调IL-18表达可显著增强胰腺癌细胞系panc-1、mia-paca-2的体外增殖、侵袭、迁移能力,下调IL-18表达可抑制增殖、侵袭、迁移能力：人重组IL-18干预增强胰腺癌细胞系panc-1、mia-paca-2的体外增殖、侵袭、迁移能力；相对于对照组,结果均有统计学意义。 2.上调IL-18表达可促进胰腺癌细胞系panc-1、mia-paca-2皮下移植瘤的生长,裸鼠在第5周逐渐出现体重下降等恶病质表现,下调IL-18表达显著抑制皮下移植瘤的形成和生长,实验裸鼠在8周实验内体重稳定增加；相对于对照组,结果均有统计学意义。 3.上调IL-18表达可增加胰腺癌肝转移灶,显著缩短荷瘤小鼠生存时间；下调IL-18表达可减少胰腺癌肝转移灶,显著延长荷瘤小鼠生存时间；相对于对照组,结果均有统计学意义。 4.IL-18可以通过促进IKKa/β的磷酸化激活NF-κB信号通路,IL-18通过NF-κB信号通路影响胰腺癌的增殖和侵袭,靶基因是MMP-3、MMP-9、c-myc和cyclin-D1, NF-κB信号通路阻滞剂BAY11-7082可以阻断IL-18对胰腺癌增殖和侵袭转移的促进作用。结论： 1.IL-18可以增强胰腺癌的增殖和侵袭转移能力。 2.IL-18调控NF-κB信号通路影响胰腺癌的增殖和侵袭转移能力,NF-κB言号通路阻滞剂BAY11-7082可以特异性阻断IL-18对胰腺癌增殖和侵袭转移的促进作用。第四部分选择性阻断其促瘤效应后IL-18对胰腺癌免疫治疗作用的研究目的：研究选择性阻断IL-18对胰腺癌增殖和侵袭转移的促进作用后,重组IL-18是否对胰腺癌具有免疫治疗作用。方法： 1.构建沉默鼠IL-18慢病毒载体,转染鼠胰腺癌细胞系LTPA,C57BL/6J和IL-18-/-C57BL/6J小鼠构建鼠胰腺癌原位移植模型,分为四个组i)LTPA/C57BL/6J、ⅱ) IL-18KD/C57BL/6J.ⅲ)LTPA/IL-18-/-C57BL/6J、ⅳ)IL-18KD/IL-18-/-C57BL/6J,监测生存时间,生长状态,肝脏、肺脏病理切片检测远处微转移灶。 2.采用鼠胰腺癌细胞系LTPA和C57BL/6J小鼠,构建鼠胰腺癌原位抑制模型,分为四个组i)PBS.ⅱ)IL-18.ⅲ)BAY11-7082.ⅳ)IL-18联合BAY11-7082,监测生存时间和生长状态。结果： 1.IL-18KD/C57BL/6J组小鼠长期生存,生长状态最好;LTPA/IL-18-/-C57BL/6J生存时间最短,生存状态最差,结果具有统计学意义。肝脏和肺脏HE病理切片示IL-18KD/C57BL/6J组小鼠无微转移灶,LTPA/IL-18-/-C57BL/6J组小鼠肝脏、肺脏微转移灶最多,结果具有统计学意义。 2.IL-18联合BAY11-7082组小鼠可以长期生存,其他三组生存时间和生存状态无明显差异；IL-18联合BAY11-7082组与其他三组相比,结果具有统计学意义。结论：只有采用BAY11-7082选择性阻断IL-18对胰腺癌的增殖和侵袭转移促进作用后,IL-18才能显著改善胰腺癌荷瘤小鼠生存状态、延长生存时间,起到免疫治疗的作用。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.9

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