Cu-MOF和Fe-MIL-101模拟酶活性及其对癌细胞的作用

发布时间：2019-01-21 08:13

【摘要】：由于生物酶对反应环境的要求苛刻,还具有相对活性较低以及不可重复利用等缺陷,使得人工模拟酶成为研究热点。基于酶在生物和工业中具有重要性,构筑高活性的模拟酶极具挑战性。癌症的发病率和致死率不断增高,尤其卵巢癌,是全球范围内发病率第二的致死率最高的妇科恶性肿瘤。目前,提高患者存活率的关键在于癌症的早期诊断以及使用新型的活性更高的抗癌试剂进行治疗。越来越多的证据表明细胞微环境在肿瘤增殖和转移中扮演重要角色,肿瘤微环境包含许多影响血管生成的信号分子。肿瘤的生长增殖依赖于血管生成为其提供氧气和营养。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMP),一种锌结合蛋白包括胶原酶MMP-2和MMP-9,能水解细胞外基质而在血管生成、肿瘤侵袭和转移中扮演重要角色。靶向肿瘤微环境和肿瘤细胞是肿瘤协同治疗的新策略。金属有机骨架材料(metal-organic frameworks,简称MOFs)是一类独特的基于金属离子或金属簇和有机配体的固态多孔材料。与传统多孔材料相比,他们具有高比表面、高孔隙度、可调孔径以及拓扑结构,使它们在很多领域的应用具有独特的优势。随着MOFs种类和结构的增多,其应用范围也在不断扩展。但到目前为止,关于MOFs细胞毒性的相关信息还很少,当下MOFs在癌症治疗中仅用作显影造影剂以及药物传输载体。没有直接将MOFs用于杀癌细胞的报道。同时也未见将MOFs用于模拟蛋白酶的报道。基于此,本论文对Cu-MOF和Fe-MIL-101材料的模拟酶活性及对癌细胞的作用(细胞消化分离、细胞检测、细胞毒性、细胞迁移、抗血管生成、抑制基质金属蛋白酶(MMP-2/9)以及肌动蛋白(actin)表达)进行研究。首次报道Cu-MOF具有模拟蛋白酶的活性并将其应用于消化分离细胞。同时发现Fe-MIL-101具有内在模拟过氧化物酶的活性并且在中性条件下具有较高的活性。我们未经表面修饰将叶酸与Fe-MIL-101结合设计和开发了一种基于Fe-MIL-101的模拟过氧化物酶活性的一种简单、便宜、高选择性高灵敏度比色检测癌细胞的方法。此外,论文还探讨了两种MOFs抑制癌细胞增殖和转移的作用机理。论文的主要内容包括：(1)将Cu-MOF用于模拟蛋白酶催化水解蛋白质,探索了反应温度、pH、反应时间等影响因素对催化反应的影响,并研究了催化动力学和反应机理。研究发现Cu-MOF具有类似于胰酶的内在模拟酶性质,米氏常数比胰蛋白酶的小26,000倍,说明Cu-MOF对BSA的亲和力高于胰酶。同时Cu-MOF对牛血清白蛋白的亲和力高于报道的大部分以Cu为催化活性中心的人工蛋白酶,且催化性能比均相催化剂Cu(Ⅱ)复合物显著提高。该催化剂具有较强的水热稳定性,循环使用十次后,催化效果基本不变。并首次将Cu-MOF用于消化分离细胞,不含EDTA的Cu-MOF能成功模拟胰酶消化细胞。本研究为MOFs的应用开辟了新的途径。(2)将Fe-MIL-101用于模拟过氧化物酶催化氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯二胺(TMB),探索了催化剂用量、反应温度、pH、H2O2用量等影响因素对催化反应的影响,并研究了催化动力学和反应机理。研究发现Fe-MIL-101在广泛pH范围具有类似天然辣根过氧化物酶的内在模拟过氧化物酶活性,甚至在中性条件下表现出较高的催化活性。以H2O2为底物时,Fe-MIL-101的米氏常数比天然辣根过氧化物酶低约616倍(pH 4.0)和20倍(pH 7.0),显示出比HRP更强的对H2O2的亲和力。另外,Fe-MIL-101不经任何表面修饰通过结合叶酸来检测癌细胞,对HeLa的检测限达到50个,且在细胞数为10个时,肉眼可分辨反应颜色。提供了一种简单、灵敏、通用的特异性检测癌细胞的方法。(3)对Fe-MIL-101抗癌活性评价,通过MTT法分析Fe-MIL-101对人宫颈癌HeLa,人非小细胞肺癌A549,人卵巢癌SKOV3、人脐静脉血管内皮细胞HUVEC和正常小鼠胚胎成纤细胞BABL-3T3的细胞毒性,发现Fe-MIL-101对卵巢癌SKOV3(IC50=23.6μg mL-1)细胞以及血管内皮HUVEC(IC50=9.9μg mL-1)细胞具有选择性抑制作用,但对正常的小鼠胚胎成纤细胞BABL-3T3(IC50=77.8 μgmL-1)的毒性较弱。通过AO/EB. Hoechst 33342和JC-1染色以及流式分析表明Fe-MIL-101通过阻滞细胞于G0/G1期和降低细胞线粒体膜电位诱导SKOV3细胞凋亡。蛋白免疫印迹法结果表明Fe-MIL-101通过下调基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的表达抑制SKOV3细胞迁移和血管生成。(4)对Cu-MOF抗癌活性评价,通过MTT法分析Cu-MOF对人非小细胞肺癌A549、人卵巢癌SKOV3、人口腔上皮癌细胞KB、人结肠直癌细胞HT-29和正常细胞：BABL-3T3的细胞毒性,发现Cu-MOF具有有效区别癌细胞和正常细胞的能力。通过AO/EB、Hoechst 33342和JC-1染色以及流式分析表明Cu-MOF凋亡通过阻滞细胞于G2/M期和降低细胞线粒体膜电位诱导SKOV3细胞凋亡。蛋白免疫印迹法结果显示Cu-MOF通过下调基质金属蛋白酶MMP-9、active-MMP-2和肌动蛋白actin的表达抑制SKOV3细胞迁移。
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【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.5
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本文编号：2412469