西妥昔单抗治疗mCRC耐药机制的研究

发布时间：2019-01-26 10:02

【摘要】：结直肠癌(colorectal cancers;CRC)是全球发病率居第三位的恶性肿瘤,它的发病与遗传因素和环境因素相关,其发病分子机制主要有:遗传不稳定性增加、甲基化表型以及KRAS、BRAF等基因的突变。近年来我国CRC的发病率呈上升的趋势,大部分患者在确诊时就已有远端转移,并且以结直肠癌的肝转移最为常见。虽然手术切除肝转移瘤可以使20-30%的患者获得治愈,但由于肝转移瘤的数目、大小、解剖位置等原因,仅有少部分的结直肠癌肝转移患者能够获得手术切除的机会,绝大部分患者是没有手术机会的。因此转移性结直肠癌(metastatic colorectal cancer;mCRC)的药物治疗尤为重要。伊立替康(irinotecan)、奥沙利铂(oxaliplatin)及氟尿嘧啶(fluorouracil)等针对CRC的化疗药物虽然能提高mCRC的疗效,但患者的中位生存期仍不到2年。进入21世纪以来,单克隆抗体已经在临床上用于治疗包括结直肠癌在内的许多疾病。并且,靶向EGFR的单克隆抗体西妥昔单抗(cetuximab)成为mCRC治疗的一个突破。西妥昔单抗与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor;EGFR)均有非常高的亲和力,可竞争性阻断EGFR与其配体-表皮生长因子(epidermal growth factor;EGF)等的结合,从而阻断EGFR下游的信号转导途径,进而抑制肿瘤细胞的生存、增殖、侵袭和转移。然而,西妥昔单抗的价格都非常昂贵,而且,西妥昔单抗单药治疗mCRC的有效率并不理想。基于这两方面,提高或改善靶向EGFR单克隆抗体的疗效成为迫切需要解决的问题。而导致靶向EGFR单克隆抗体治疗mCRC有效率不高的主要原因是存在极其严重的耐药问题,所以,探索靶向EGFR单克隆抗体的耐药机制并找到解决方案成为提高其疗效的重中之重。目前,对于靶向EGFR单克隆抗体的原发耐药机制的研究主要集中在EGFR信号通路的基因上,通过筛查肿瘤标本中KRAS、BRAF、NRAS、PIK3CA和PTEN等预测因子的突变情况来筛选出原发耐药的患者。然而,对已经进行了原发肿瘤根治性切除的转移性结直肠癌患者而言,受转移灶的大小和位置等原因限制,获取转移灶的肿瘤组织在临床常常是较为困难的,而且对患者本身可能会造成一定的伤害,存在着较大的风险。此外,肿瘤组织还存在着一定的肿瘤异质性。因此进一步研究探索新的耐药机制非常必要。本研究的主要目的即为研究探索导致靶向EGFR单抗耐药的新的分子机制,找到克服耐药的方法,提高单克隆抗体的疗效,为患者的个体化治疗提供理论基础。首先,通过对798株细胞系基因表达谱的数据进行生物信息学分析,结合文献报道的细胞株对西妥昔单抗的敏感性和耐药性,我们发现PRSS1在西妥昔单抗耐药细胞株中的表达水平明显高于西妥昔单抗敏感细胞株。PRSS1基因编码一种丝氨酸蛋白酶,也被称为胰蛋白酶原,是一种主要由胰腺分泌的用于激活各种蛋白酶的消化酶。在肿瘤的进展过程中,PRSS1可能参与了肿瘤的侵袭和转移。接着,我们检测了八株结肠癌细胞系中PRSS1的表达水平,同样发现PRSS1在对西妥昔单抗耐药结肠癌细胞系中的表达水平明显高于敏感的结肠癌细胞系。另外,通过免疫组化实验检测49例使用西妥昔单抗治疗的结肠癌患者肿瘤组织中PRSS1的表达水平。发现:在19例对西妥昔单抗原发耐药的患者的肿瘤标本中,16例患者的肿瘤标本均表达PRSS1,仅3例患者肿瘤标本不表达PRSS1;而在30例对西妥昔单抗治疗有效的患者的肿瘤标本中,仅5例患者的肿瘤标本中检测到PRSS1的表达,其余25例患者的肿瘤标本均为PRSS1表达阴性;即对西妥昔单抗治疗原发耐药的患者,其肿瘤标本中PRSS1的表达水平明显的高于对西妥昔单抗治疗有效患者的肿瘤标本。这些结果充分显示PRSS1的表达水平与西妥昔单抗的疗效相关。为了进一步验证PRSS1可以导致西妥昔单抗的耐药,我们对结肠癌细胞进行了PRSS1的敲低和过表达实验。首先,采用针对PRSS1的shRNA敲低了HT-29和LoVo细胞中PRSS1的表达,发现:成功敲低这两株结肠癌细胞中PRSS1的表达水平后,细胞对西妥昔单抗的耐药性显著减弱;反之,我们对PRSS1表达水平低的DiFi和LoVo细胞进行了PRSS1的过表达,发现:成功过表达PRSS1之后,这两株结肠癌细胞对西妥昔单抗的耐药性明显增强;即干预细胞中PRSS1的表达水平可以影响细胞对西妥昔单抗的耐药性。为了探索PRSS1导致西妥昔单抗耐药的具体分子机制,我们用免疫印迹实验检测PRSS1对单克隆抗体的降解。发现PRSS1通过降解西妥昔单抗,使其对EGFR信号通路的抑制明显减弱,进而导致耐药。对PRSS1降解西妥昔单抗的降解片段进行N端测序,发现PRSS1可以识别和降解包括西妥昔单抗、贝伐珠单抗和曲妥珠单抗在内的单克隆抗体类药物,使单克隆抗体类药物的功能和疗效减弱,进而导致耐药。另外,PRSS1降解单克隆抗体存在着序列特异性,针对这种序列特异性,对预测的PRSS1识别单克隆抗体的位点进行突变,可以改变单克隆抗体被PRSS1降解的程度,进而提高单克隆抗体的疗效。接着,我们进行了裸鼠荷瘤实验。发现PRSS1的抑制剂SPINK1可以很好的抑制PRSS1对单克隆抗体的降解,从而提高单克隆抗体的疗效。即单克隆抗体与PRSS1的抑制剂SPINK1的联合用药,可以显著地提高单克隆抗体的疗效,更好地抑制肿瘤的生长和增殖。进一步在临床水平进行验证,我们检测了54例使用西妥昔单抗进行治疗的患者血清中PRSS1的水平。发现:血清中PRSS1的水平较高的肿瘤患者对单克隆抗体的疗效普遍较差。患者血清中PRSS1的水平越高,患者的无疾病进展期就越短,即PRSS1的高表达可导致肿瘤患者对西妥昔单抗产生耐药性。连续检测患者在西妥昔单抗治疗过程中血清PRSS1的水平,发现PRSS1可以做为单克隆抗体的一个疗效预测分子。总而言之,PRSS1在导致单克隆抗体的耐药中发挥着重要的作用,并且,PRSS1可作为一种辅助临床用药的疗效预测分子,即临床上通过监测患者体内PRSS1的表达水平,可预测患者对单克隆抗体的疗效,并及时更换有效的治疗方案,以提高患者的疗效、改善患者的生活质量。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.34

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