基于拉曼光谱的乳腺癌微钙化的分子学特征及形成机制研究

发布时间：2019-03-31 17:30

【摘要】：特定分布于乳腺内的微钙化灶是乳腺癌的一个重要特征,也可能是部分早期乳腺癌的唯一征象,检测并鉴别微钙化的性质可能成为早期诊断乳腺癌的重要手段。拉曼光谱技术是一种拥有巨大潜力的乳腺疾病诊断技术,目前对于该方法的研究工作主要集中于乳腺肿瘤、微钙化的检测、诊断以及术中应用方面。但这些研究的对象多为石蜡病理切片,经过福尔马林固定及石蜡包埋处理会产生荧光背景,从而影响拉曼光谱分析。目前为止,研究中尚没有对新鲜乳腺组织中的微钙化进行检测及分析。而且对于乳腺肿瘤中微钙化的形成方式和原因研究较少,目前亦没有乳腺细胞钙化体外模型的存在以研究该过程中的分子机制。为此,本研究首先使用共聚焦显微拉曼光谱检测新鲜乳腺组织连续冰冻切片,以区分纤维腺瘤、癌前病变即导管上皮非典型增生、导管内癌和浸润性导管癌中的微钙化,通过拉曼光谱分析这些组织中微钙化的生化特征。随后,基于这些特征进一步研究乳腺癌细胞中微钙化形成机制,探讨乳腺癌细胞中骨桥蛋白的表达与乳腺癌细胞微钙化形成的相关性。基于以上的研究思路,本论文的主要研究内容如下:(1)基于拉曼光谱的乳腺癌组织微钙化的分子学特征研究使用共聚焦显微拉曼光谱检测乳腺组织连续冰冻切片,准确定位微钙化的位置。将壳层隔绝纳米粒子增强拉曼光谱技术(SHINERS)用于检测乳腺纤维腺瘤,癌前病变,导管内癌和浸润性癌组织冰冻切片,描述了乳腺组织冰冻切片中微钙化的拉曼光谱分子学特征。钙化灶主要特征峰为960cm-1,可以归属为羟基磷灰石钙化磷酸盐(PO4)的振动模式,为II型微钙化。同时也检测到了其他几类生化成分的特征峰如类胡萝卜素、脂类、蛋白质和核苷酸等的出现,而且这些较弱的特征峰在这四种病变组织之间也存在一些差异。首先,从乳腺导管上皮非典型增生到导管内癌,再到浸润性癌组织癌变过程中,蛋白质和核苷酸的含量逐渐增加而脂类的含量逐渐降低。其次,乳腺纤维腺瘤和非典型增生中有相同的1072cm-1特征峰,可归属为核苷酸。这表明在乳腺病变组织中微钙化沉积位置同时伴有核苷酸沉积。但在乳腺导管内癌和浸润性癌组织中该特征峰由1072cm-1位移到1078cm-1位置,该位移可能是由于不同疾病组织中微钙化的成分不同而导致。同时在乳腺导管内癌和浸润性癌组织中,酰胺I特征峰(1653cm-1)消失。这可能是由于在细胞癌变过程中蛋白质构象被破坏而导致。此外,导管内癌和浸润性癌组织中CH2特征峰(1446cm-1)发生蓝移,这可能预示着脂类和蛋白质酰基骨架的断裂。同时使用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)方法分析光谱数据,我们发现使用SHINERS拉曼光谱,可以有效的区分乳腺癌前病变组织即导管上皮非典型增生和导管内癌组织,准确率分别高达99.78%和97.62%。但是对于乳腺浸润性癌组织使用SHINERS后其准确率下降,其灵敏度为100%,特异性为99.17%,阳性预测值为97.56%,阴性预测值为100%。可以利用微钙化的拉曼光谱特征准确识别并诊断乳腺纤维腺瘤、非典型增生、导管内癌和浸润性癌组织。(2)基于拉曼光谱的乳腺癌细胞微钙化形成机制研究研究中将β甘油磷酸盐和抗坏血酸(即成骨鸡尾酒)添加到高侵袭性乳腺癌MDA-MB-231细胞系、SUM149、SUM159以及MDA-MB-468细胞系,以及低侵袭性乳腺癌MCF-7、BT-474、T-47D以及SKBR-3细胞系特定培养基中,诱导细胞体外产生钙化,成功建立乳腺细胞系体外钙化模型,验证了乳腺癌细胞系体外产生钙化的能力。该8种细胞系经成骨鸡尾酒处理后,在第7天经茜素红染色发现产生钙化物质。拉曼光谱用来识别MDA-MB-231人乳腺癌细胞所产生钙化沉积的种类,其960cm-1处拉曼特征峰表明羟基磷灰石的出现,与之前在新鲜乳腺组织冰冻切片中检测到的微钙化成分一致。随后以人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231为主要研究对象,探索骨桥蛋白与乳腺癌微钙化形成的相关性,结果发现经成骨鸡尾酒诱导后骨桥蛋白基因表达明显上调(p=0.0009)。而后,使用骨桥蛋白sh RNA慢病毒载体将人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的骨桥蛋白进行基因敲除,以观察其是否仍能产生钙化。细胞基因敲除成功后加成骨鸡尾酒培养7天后茜素红染色的定量结果发现细胞骨桥蛋白基因敲除后微钙化产生的量明显减少(p0.001),这表明细胞骨桥蛋白在人乳腺癌细胞微钙化形成中起关键作用。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
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本文编号：2451122