miR-146a通过靶定IRS2表达影响食管鳞癌生物学行为的机制研究

发布时间：2019-04-11 21:24

【摘要】：前言食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)作为我国常见的消化道恶性肿瘤,具有病死率高、治疗效果差的特点。目前ESCC的发病率仅次于肺癌、胃癌和肝癌。ESCC病因复杂,主要涉及吸烟、饮酒、流经食物过热、食管反流与遗传等因素。因此,ESCC的生物学标记物筛选和信号通路的阐明对ESCC诊疗具有重大意义。众所周知,细胞信号通路传导需要细胞因子刺激,进而通过胞膜或胞内受体传导到核内,调节相关基因表达,参与细胞的各种生理病理活动。在ESCC的过程中,细胞增殖起着重要的作用,ESCC发生发展时期,细胞增殖旺盛,伴随着各种增殖相关通路的紊乱。体内多种信号分子已被证实参与肿瘤细胞增殖过程。因此,对于细胞信号通路中关键分子的研究成为ESCC分子机制以及治疗的研究热点。微小RNA (microRNA, miRNAs)是一类长度在21～25个核苷酸的非编码RNA,由基因组转录调控,并在转录后水平控制基因表达,进而参与炎症、免疫应答、细胞增殖与凋亡等。随着cDNA文库、分子克隆技术、RNA组学及生物信息学预测的不断发展,miRNA在基因调控中的地位越来越突出,很多热点miRNA已经在临床疾病诊断、治疗和预后的分析中得到应用。目前的研究报道均表明,miRNAs与肿瘤疾病的发生发展紧密关联,其中,miR-146a是众多科学家研究的重点。最新的成果表明,TOLL样受体TLR2/4/5的配体以及TNF-α、IL-1等炎症因子都是通过NF-κB依赖的途径上调miR-146a的表达,上调后的miR-146a进而抑制TRAF6等蛋白上调,进一步影响NF-κB的蛋白活性,从而减少NF-κB通路下游TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子生成,阻止过度免疫反应。另外,胰岛素受体底物(insulin receptor substrate, IRS)是近年来发现的胰岛素信号通路中一个重要蛋白。迄今为止,研究证实IRS具有四个亚型,其中,IRS1和IRS2尤为关注。IRS1广泛分布于胰岛素作用的所有外周组织,如骨骼肌、脂肪和肝脏,其主要在骨骼肌中表达。目前,人类和鼠IRS1的氨基酸序列已经证实具有高度种属性和组织保守性。IRS1的N末端有两个保守的结构域,包括PH(pleckstrin homology)和PTB(phosphotyrosine binding)。PH结构域介导磷脂与含有酸性结构的蛋白相互作用。PTB结构域能够识别磷酸化NPXY的酪氨酸残基,使IRS1能够和IGF-1R和胰岛素受体IR近膜区的Tyr950或Tyr960发生耦联。总之,IRS1在机体的外周组织代谢、细胞增殖和分化中起着重要的作用。近年来,IRS2在肿瘤生长、增殖与迁移中的作用也越来越重视。本研究通过检测miR-146a在食管鳞癌组织及癌旁正常组织中的表达情况,结合临床病理参数进行分析,探讨miR-146a与食管鳞癌临床病理指标的关系。同时,本组检测miR-146a和IRS2在食管鳞癌细胞株中的表达变化,通过基因转染技术观察miR-146a对IRS2基因转录后表达过程的影响,进而明确]miR-146a/IRS2靶基因网络在食管鳞癌诊疗中的意义。方法与结果：1、Real-time PCR检测miR-146a在食管鳞癌组织中的表达及与临床指标的关系本组通过Real-time PCR技术检测了miR-146a在60例食管鳞癌组织中的表达情况。在60例食管鳞癌周围正常组织中,miR-146a的表达量为10.10-±2.30；然而miR-146a在食管鳞癌组织中的表达量为3.464-1.22,较正常食管组织有显著下调,差异具有统计学意义。通过分析miR-146a与多项临床病理指标的关系发现,miR-146a与食管鳞癌的分化程度(p=0.021)、淋巴结转移(p=0.004)以及临床分期(p=0.039)显著相关,而与其它年龄、性别等临床指标无统计学相关性。结果提示,miR-146a在食管鳞癌组织中的表达水平较正常组织显著下降；同时,miR-146a可能参与食管鳞癌的发生、发展与转移的过程。2、miR-146a在人食管鳞癌细胞系中的表达本组提取ESCC细胞的总RNA,用特异的：miR-146a反转录引物反转成cDNA, Real-time PCR检测miR-146a在三种不同分化程度的ESCC细胞株中的表达情况并使用食管正常上皮HEEC细胞进行对照。以2-,xzxCT法来计算miR-146a的表达量,以U6作为内参。本组发现,miR-146a在HEEC中高表达,表达量明显高于三种ESCC细胞株。在高分化的EC109细胞中,miR-146a的表达量显著下降,与HEEC相比具有统计学差异(p0.05)。在中分化的TE8细胞中,miR-146a的表达量进一步下调。在低分化TE2细胞中,miR-146a的表达量达到了最低。3、IRS2在人食管鳞癌细胞系中的表达并受miR-146a的调节本组利用Real-time PCR和Western blot分别检测IRS2在正常HEEC细胞及3株食管鳞癌细胞EC109、TE8和TE2中mRNA和蛋白的表达水平。结果发现,食管鳞癌细胞系中,IRS2的]mRNA水平和蛋白表达水平随分化程度逐渐增强。通过Microinspector、 miRanda及targetscan三个预测软件预测miR-146a对IRS2具有生物信息学上的调控作用,那么miR-146a可能在转录后水平调控IRS2表达。本组进而设计双荧光素酶报告基因系统验证miR-146a对IRS2 3'URT的影响。通过转染miR-146a的mimics或者NCmiRNA来调节miR-146a的表达水平,然后检测IRS2的蛋白表达水平；对比发现,miR-146a能够显著下调IRS2蛋白水平。结果提示miR-146a能够通过与IRS2 3'URT区结合,抑制IRS2翻译而下调其表达。4、miR-146a抑制食管鳞癌增殖、迁移以及侵袭选取ESCC的细胞株EC109与TE8,通过转染miR-146a的mimics来调节miR-146a的表达水平；CCK-8与小室迁移侵袭试验分别检测细胞的增殖、迁移和侵袭。相比于对照组,上调]miR-146a的表达后EC109与TE8细胞的增殖、迁移能力、侵袭能力显著下降,而对照组的增殖、迁移与侵袭能力没有发生显著的变化。结果证实,下调miR-146a能显著促进食管鳞癌转移及侵袭进程。5、过表达IRS2能够逆转miR-146a抑制的ESCC细胞生物学行为本组通过迁移实验发现,在共转染pc-IRS2组的EC109细胞中,上调IRS2表达后的细胞组的迁移能力显著增加；而在共转染pc-DNA对照组的EC109细胞的细胞迁移能力显著下降,二者具有显著差异。结果提示,过表达IRS2后能显著解除miR-146a抑制的迁移能力。本组通过细胞侵袭实验发现,在共转染pc-IRS2的EC109细胞中,IRS2的表达水平上调且能显著增加穿过基质胶的细胞数目,而在共转染pc-DNA对照组中,穿过基质胶的EC109细胞数目明显下降,二者具有显著差异。结果提示,过表达IRS2后能显著解除miR-146a抑制的侵袭能力。结论：本组首次检测miR-146a在食管鳞癌中的表达水平,证实miR-146a在食管鳞癌细胞系、原发癌组织及淋巴转移组织中表达水平均显著下降,且miR-146a的表达下调与食管鳞癌的转移呈正相关,提示niR-146a在食管鳞癌的转移中发挥了重要的作用。以三种不同分化程度的食管鳞癌细胞为模型,本组阐明miR-146a通过抑制IRS2基因的转录后翻译而下调IRS2的表达,明确miR-146a-IRS2系统在肿瘤分化、增殖、侵袭与转移中的作用机制,揭示了miR-146a-IRS2的全新调控方式。同时,本研究更将为ESCC临床诊断提供了可行的标志物。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1

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