桑辛素通过下调c-Myc的表达来抑制胃癌细胞的增殖和肿瘤生长

发布时间：2019-05-08 20:38

【摘要】：近年来尽管胃癌的发病率有所降低,但是其依旧是世界上患者最多的癌症之一。在发展中国家中,胃癌是致死率最高的三种癌症之一,每年约有十万胃癌新生病人。虽然我们在胃癌的放化疗方面取得了极大的进步,但是胃癌病人的预后情况依旧不理想,平均五年的生存率不到30%。因此,筛选有效的胃癌药物,对于提高胃癌病人的治疗效果及生存率拥有非凡的意义。黄酮类化合物包括黄酮、黄烷酮、异黄酮、二氢异黄酮、二氢查尔酮等几大类,据报道黄酮类化合物具有抗肿瘤活性。比如,黄芩素作为一种派生类黄酮,拥有多种不同的生物活性,其可以诱导膀胱癌的凋亡,同时还可以抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。另外黄酮前体查尔酮可以通过抑制NF-κB的活性从而抑制胃癌细胞的生长,同时可以上调DR4和DR5的表达,从而引起结肠癌和肝癌的凋亡。桑辛素作为一种桑白皮(桑树根部的皮)富含的黄酮类化合物,据报道其可以通过抑制NF-κB的活性来诱导宫颈癌和结肠癌的凋亡。同时能够通过调节EGFR及DR5的活性,来诱导胶质瘤细胞的凋亡。不仅如此,同时桑辛素能够抑制STAT3的活性,从而诱导前列腺癌细胞的死亡。基于目前研究现状,我们提出假设:桑辛素可以抑制胃癌细胞的细胞增殖和肿瘤生长。通过增殖率分析、western blot、细胞周期分析等实验,本文发现桑辛素的确拥有抑制胃癌细胞生长和肿瘤生长的能力。实验主要结果如下:1.桑辛素通过将细胞周期阻滞在G1期来抑制胃癌细胞的增殖使用不同浓度的桑辛素对两种胃癌细胞系(MKN45及SGC7901)进行处理后,细胞增殖率结果显示,桑辛素显著地抑制了胃癌细胞的增殖,同时MTT实验及BrdU实验也得到了同样的结果。为探索桑辛素抑制胃癌细胞增殖的机制,进行了细胞周期分析,结果显示桑辛素可以将胃癌细胞阻滞在G1期。同时为了探索桑辛素阻滞细胞周期的分子机制,通过western blot实验对细胞周期相关蛋白表达进行检测,发现桑辛素下调了CDK2,CDK4,Cyclin D1以及Cyclin E1的表达。以上实验结果表明,桑辛素可以下调细胞周期相关蛋白的表达,从而抑制胃癌细胞的细胞周期进程及细胞增殖。2.桑辛素可以显著抑制胃癌细胞的成瘤为探索桑辛素对胃癌细胞体外成瘤的影响,我们进行了Soft Agar实验,结果显示相对于对照组而言,桑辛素处理组克隆数目较少且体积较小,桑辛素抑制了胃癌细胞体外成瘤。同时进行了小鼠移植瘤实验,对肿瘤生长情况进行统计分析发现,桑辛素显著抑制了肿瘤的生长。对各组肿瘤进行免疫组化分析,结果显示桑辛素处理组生长标志物Ki67阳性细胞率显著下降。对CDK2,CDK4,Cyclin D1以及Cyclin E1在肿瘤中的表达情况进行分析发现,四种周期蛋白表达均显著降低。以上实验结果表明,无论在体内还是体外,桑辛素均可通过阻滞细胞周期来抑制肿瘤的生长。3.桑辛素通过下调c-Myc的表达来抑制细胞周期相关蛋白的表达Western blot实验表明桑辛素可以下调c-Myc的表达,并且这种下调作用有时间和浓度的依耐性,免疫组化分析也表明桑辛素可以抑制c-Myc在肿瘤内的表达。为了研究c-Myc在桑辛素调节细胞增殖中的作用,我们构建了c-Myc过表达的胃癌细胞系。对正常的胃癌细胞系和过表达c-Myc细胞系进行药物处理后,MTT实验结果表明,c-Myc可以减缓桑辛素对胃癌细胞增殖的抑制作用。在c-Myc过表达的细胞系中,四种细胞周期蛋白(CDK2,CDK4,Cyclin D1以及Cyclin E1)的表达均有不同程度的上调。由于c-Myc是通过识别“E-box”序列,从而结合到靶基因的启动子上来调控下游基因的表达,为研究c-Myc是否结合到CDK2,CDK4,Cyclin D1以及Cyclin E1的启动子上,我们进行了ChIP实验。ChIP实验结果表明c-Myc可以通过识别“E-box”序列,从而结合到CDK4,Cyclin D1以及Cyclin E1的启动子上。虽然CDK2启动上也存在“E-box”序列,但是我们的结果并没有发现c-Myc可以结合到CDK2的启动子。综上所述,桑辛素通过下调c-Myc的表达来抑制细胞周期相关蛋白的表达。4.桑辛素通过下调c-Myc的表达来抑制细胞周期和肿瘤生长基于我们前期的实验结果,我们提出假设:桑辛素通过下调c-Myc的表达来抑制细胞周期进程。为了验证我们的假设,在过表达c-Myc和正常的胃癌细胞添加桑辛素处理后,进行细胞周期分析,结果显示过表达c-Myc可以显著降低处于G1期的细胞比例。western blot实验结果表明,在桑辛素处理后,过表达c-Myc细胞系相对于对照组而言,CDKs以Cyclins的表达量都相对较高,以上实验结果表明,过表达c-Myc可以减缓桑辛素对胃癌细胞细胞周期的阻滞。我们发现桑辛素可以显著抑制c-Myc的表达,且原癌基因c-Myc在肿瘤发生和生长方面发挥着重要的作用,所以在对过表达c-Myc的细胞系和正常胃癌细胞系进行药物处理后,在体外我们检测了各组细胞的成瘤能力,结果表明过表达c-Myc的细胞系相对于对照组而言,成瘤数目有显著的提升。小鼠移植瘤实验也表明,过表达c-Myc可以减缓桑辛素对肿瘤生长的抑制作用。以上实验结果表明桑辛素通过下调c-Myc的表达来抑制细胞周期和肿瘤生长。综上所述,通过增殖率检测、MTT实验以及BrdU染色,发现桑辛素可以显著抑制胃癌细胞的增殖。进一步实验我们发现桑辛素通过下调细胞周期相关蛋白的表达,将胃癌细胞阻滞在G1期,从而抑制胃癌细胞的增殖,同时桑辛素还可以抑制胃癌细胞的成瘤能力。并且我们发现桑辛素抑制细胞增殖和成瘤均是通过下调c-Myc的表达来实现的。由于c-Myc在许多胃癌病人中都存在异常的高表达,且c-Myc的异常高表达往往会导致病人的预后变差,本研究发现桑辛素可以显著抑制原癌基因c-Myc的表达,表明桑辛素拥有成为胃癌治疗药物的潜力。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2

【参考文献】