微环境CAF中GPER介导HMGB1外分泌促进乳腺癌MCF-7细胞自噬及增殖

发布时间：2019-05-31 20:00

【摘要】：目的:探讨活化微环境肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast,CAF)中G蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor,GPER)外分泌HMGB1对乳腺癌MCF-7细胞自噬水平和增殖的影响。方法:通过分析课题组前期TAM与TAM联合GPR30特异性抑制剂G15处理CAF细胞的mRNA芯片数据,筛选出其中表达差异的分泌因子,从中挑选出细胞因子HMGB1,并用qRT-PCR和Western blot法验证芯片结果。构建靶向干扰GPER基因的shRNA慢病毒,稳定转染至CAF细胞,RT-q PCR法及Western blot法分别检测阴性对照慢病毒感染组(CAF-shNC组)与GPER-shRNA慢病毒感染组(CAF-shGPER组)中GPER的mRNA和蛋白表达情况。利用GPER特异性激动剂G1(1μmol/L)处理以上两组细胞后,分别得到G1+CAF-shNC组与G1+CAF-shGPER组,运用RT-qPCR法、Western blot法及ELISA法检测上述各组细胞中细胞因子HMGB1的mRNA和蛋白表达量以及条件培养基中HMGB1的分泌量。加入不同浓度的外源性重组蛋白HMGB1和收集以上各组条件培养基及上述各组培养1本课题由国家自然科学基金81372398资助基分别加入HMGB1-中和抗体处理MCF-7细胞,应用Western blot法、CCK8法检测肿瘤细胞自噬蛋白标志物Beclin1、P62及LC3的表达情况和增殖能力。结果:在前期基因芯片结果中发现GPER介导了CAF细胞分泌多种细胞因子,而细胞因子在经TAM处理CAF细胞中HMGB1mRNA和蛋白的表达上调(P值均0.01),而对于该种效应可被G15阻断(P值均0.01)。稳转慢病毒shGPER至CAF细胞后,GPER的表达被明显抑制(P0.01)。GPER特异性激动剂G1可显著上调CAF-shNC组中细胞因子HMGB1的mRNA及蛋白表达水平,且进一步增加条件培养基中HMGB1的分泌量(P0.05)。然而,在G1+CAF-shGPER组中以上效应则被显著抑制。外源性的HMGB1可以促进MCF-7细胞增殖及自噬的发生,同样外分泌至条件培养基中的HMGB1可通过上调Beclin1、LC3蛋白及降低P62蛋白表达增加乳腺癌MCF-7细胞的自噬水平及其增殖能力(P0.01),并受CAF中GPER的活化情况所调控。结论:GPER介导了CAF细胞分泌细胞因子HMGB1,进而诱导乳腺癌MCF-7细胞发生自噬,保护MCF-7细胞促进其生长。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.9

【参考文献】