SIRT2在急性髓系白血病多药耐药中的作用研究

发布时间：2019-07-31 15:10

【摘要】：研究背景：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是血液病中最常见的疾病。目前,药物化疗是治疗AML的主要方法,大部分患者可以经过化疗后得到缓解。但是,部分患者在经过治疗后不能得到完全缓解,另外,完全缓解后的患者中仍有很大部分会复发,最终导致治疗失败。白血病细胞的原发耐药及复发耐药是治疗失败的主要原因。深入探索白血病细胞耐药过程中的分子机制,提高白血病细胞对治疗药物的敏感性是目前研究的热点。SIRT2是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)依赖性的第三类组蛋白去乙酰化酶Sir2家族成员之一,可通过去乙酰化作用参与细胞分化、细胞内信号转导、细胞迁移、增殖等活动。研究表明SIRT2可参与调节AML细胞的增殖、凋亡和分化活动,但其在AML细胞多药耐药中的作用和机制尚不明确。目的：在原发和复发AML患者细胞中筛查SIRT2是否参与AML对药物的耐受性,并以AML耐药细胞株HL60/A及对药物相对敏感的亲代细胞株HL60为研究对象,研究SIRT2在多药耐药中的生物学作用及其机制。方法：1、对2013年4月～2014年1月中国医学科学院血液病医院收治的25例儿童急性淋巴细胞白血病(children acute lymphoblastic leukemia, children-ALL)患者,20例成人急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)患者,10例原发性血小板增多症(essential thrombocythemia, ET)患者,11例慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)患者,8例真性红细胞增多症(polycythemia vera, PV)患者,11例骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasm, MPN)患者及15例AML患者骨髓标本进行研究,并收集6例正常供者骨髓标本为对照。分离单个核细胞,应用实时定量PCR方法检测骨髓单个核细胞中SIRT2基因的表达水平；2、对2013年4月～2014年1月本院收治的15例原发AML患者及10例复发AML患者骨髓标本进行研究,分离单个核细胞,应用实时定量PCR方法检测骨髓单个核细胞中SIRT2基因的表达水平；3、应用实时定量PCR方法及Western Blot的方法检测AML耐药细胞株HL60/A及对药物相对敏感的亲代细胞株HL60中的SIRT2的表达水平；4、利用RNA干扰方法,构建靶向SIRT2基因的特异性干扰载体,转染SIRT2高表达的HL60/A细胞株,并采用RT-PCR、免疫荧光和Western Blot方法检测下调后细胞内SIRT2的表达变化,筛选获得SIRT2表达水平下调的细胞(HL60-SIRT2-sh)。采用激光共聚焦显微镜检测阿霉素(doxorubicin, DOX)在细胞内的蓄积,MTT实验检测SIRT2沉默前后HL60/A细胞分别对药物柔红霉素 (daunorubicin, DNR)和阿糖胞苷(arabinocytidine, Ara-C)敏感性的变化,利用Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI双染及Western Blot方法检测SIRT2沉默对柔红霉素和阿糖胞苷诱导细胞凋亡能力的影响：5、利用分子克隆技术构建SIRT2的慢病毒表达载体,转染SIRT2低表达的HL60细胞,使其过表达SIRT2,采用RT-PCR、免疫荧光和Vestern Blot方法检测上调后细胞内SIRT2的表达变化,筛选获得SIRT2表达上调的细胞(HL60-SIRT2)。采用激光共聚焦显微镜检测阿霉素(DOX)在细胞内的蓄积,MTT实验检测过表达SIRT2前后HL60细胞对药物柔红霉素(DNR)和阿糖胞苷(Ara-C)敏感性的变化,利用Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI双染及Western Blot方法检测过表达SIRT2对柔红霉素和阿糖胞苷诱导细胞凋亡能力的影响；6、采用Western Blot方法检测上述干扰、过表达SIRT2基因的细胞中多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein, MRP1)的变化,对ERK1/2、磷酸化ERK1/2表达的影响以及相关蛋白P53和BCL-2的表达变化,进一步采用ERK1/2信号通路抑制剂PD98059研究ERK1/2信号通路在SIRT2参与调控AML多药耐药过程中的作用。结果：1、在多种白血病患者细胞中SIRT2的表达水平均明显高于正常对照组,差异具有统计学意义(P0.05)；复发AML患者与原发AML患者比较,细胞中SIRT2的表达量增高,差异具有统计学意义(P0.05)；2、在AML耐药细胞株HL60/A中,SIRT2 mRNA及蛋白表达水平均明显高于其亲代细胞系HL60(P0.05)；3、成功构建了SIRT2稳定干扰的HL60/A细胞株：HL60-SIRT2-shl及HL60-SIRT2-sh2;激光共聚焦显微镜检测反射红色荧光的阿霉素(DOX)在细胞内的蓄积,结果显示SIRT2表达下调使得阿霉素在细胞内的蓄积量增加；MTT实验结果显示沉默SIRT2基因后增加了HL60/A细胞对柔红霉素和阿糖胞苷药物的敏感性；凋亡实验结果显示SIRT2基因沉默的HL60/A细胞在柔红霉素、阿糖胞苷药物分别处理后凋亡细胞所占比例均比对照组升高,凋亡效应蛋白caspase-3、caspase-7、 caspase-9及caspase-PARP的剪切活化形式均较对照组明显增加,表明SIRT2基因沉默使多药耐药细胞株HL60/A对阿霉素、柔红霉素及阿糖胞苷的敏感性增强；4、成功构建了SIRT2过表达的HL60细胞株(HL60-SIRT2);激光共聚焦显微镜检测阿霉素在细胞内的蓄积,结果显示SIRT2的过表达使得阿霉素在细胞内的蓄积量减少；MTT实验结果显示过表达SIRT2后,HL60细胞对柔红霉素和阿糖胞苷药物的敏感性减弱；凋亡实验结果显示过表达SIRT2的HL60细胞在柔红霉素、阿糖胞苷药物分别处理后凋亡细胞所占比例均较对照组降低,凋亡效应蛋白caspase-3、 caspase-7、caspase-9及caspase-PARP的剪切活化形式均较对照组明显减少,表明SIRT2的过表达使HL60细胞对阿霉素、柔红霉素和阿糖胞苷的敏感性降低；5、检测SIRT2基因沉默与过表达细胞中MRP1的表达,结果显示在SIRT2基因沉默的HL60/A细胞中MRP1的表达量降低,而在SIRT2基因过表达的HL60细胞中MRP1的表达量增高,表明SIRT2能够调节MRP1的表达水平；在SIRT2基因沉默的细胞中ERK1/2及其磷酸化水平、P53和BCL-2的表达水平均有变化,其中ERK1/2及其磷酸化水平和BCL-2表达量均降低,P53表达量增高；而在SIRT2基因过表达的细胞中这些蛋白的表达量或磷酸化水平的变化与SIRT2基因沉默细胞中的变化相反；提示在AML细胞中SIRT2表达量的变化能引起ERK1/2相关信号通路活性的改变；6、进一步采用ERK1/2信号通路抑制剂PD98059研究ERK1/2信号通路在SIRT2参与调控AML多药耐药过程中的作用。结果显示,在SIRT2基因沉默的HL60/A细胞或SIRT2基因过表达的HL60细胞中,加入ERK1/2信号通路抑制剂PD98059之后,均能够参与由SIRT2表达量变化所应起的相应改变,提示SIRT2通过调节ERK1/2信号通路的活性影响AML多药耐药。结论：1、在儿童ALL、成人ALL、ET、CML、PV、MPN及AML等血液病患者骨髓中存在SIRT2高表达的现象,AML中复发患者骨髓细胞中SIRT2的表达量高于原发患者。在AML耐药细胞株HL60/A中,SIRT2基因的表达量明显高于对药物敏感的亲代细胞HL60。上述研究结果首次报道SIRT2在多种血液病中的表达情况,提不SIRT2可能参与急性髓系白血病多药耐药的过程。2、SIRT2的表达能够正调控AML细胞对阿霉素、柔红霉素和阿糖胞苷的耐药水平,在SIRT2高表达的HL60/A细胞中下调SIRT2的表达能够减弱HL60/A细胞对柔红霉素等药物的耐药能力,而在SIRT2相对低表达的HL60细胞中过表达SIRT2则能够增加HL60细胞对阿霉素、柔红霉素和阿糖胞苷的耐药能力,以上研究结果证实了SIRT2的表达水平能够调节AML细胞对阿霉素、柔红霉素等药物的耐药能力。此外,研究还揭示ERK1/2信号通路介导了SIRT2在AML细胞多药耐药过程中的调节作用。研究为探索SIRT2在一些血液病发生发展过程中的作用和进一步阐明AML细胞的多药耐药机制奠定了理论基础。
【图文】：

代表与正常对照组相比，，尸＜0．0５，代表与正常对照照组相比，尸＜０．００１。逡逑ｅ邋ｍ民ＮＡ邋ｅｘｐ化ｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＳＩＲＴ２邋ｉｎ邋ｂｏｎｅ邋ｍａｒｒｏｗ邋ｍｏｎｏｆｆｅｒｅｎｔ邋ｌｅｕｋｅｍｉａ邋ｗａｓ邋ｄｅｔ；ｅｃｌ；ｅｄ邋ｂｙ邋ｒｅａｌ邋ｔｉｍｅ邋ｑｕａｎｔｉｌ；ａｔｉｖｅ邋Ｐｅａｎ±ＳＤ邋ｏｆ邋ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ邋ｉｎ邋ａｎ邋ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．邋＊尸＜ｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．逡逑ＮＡ在原发性和复发性ＡＭＬ患者骨髓单个核细胞中液病中的xO究仅有关于ＳＩＲＴ２参与调节急性髓系白早幼粒细胞白血病细胞分化的报道。在己有的报道量随着病人病情的加重而增多，然而针对这一现象并提示我们ＳＩＲＩ７可能参与调节ＡＭＬ细胞的多药耐原发性ＡＭＬ患者的骨髓标本和１０例复发性ＡＭＬ患单个核细胞，采用实时定量ＰＣＲ方法统计ＳＩＲＴ２邋ｍＳＩＲＴ２在复发性ＡＭＬ患者骨髓单个核中的表达量确异具有显著性意义ＣＰ＜０．００１）。逡逑逡逑

中国医学科学院北扣协和医学院辟±研巧化学位论文ｅｌａｔｉｖｅ邋ｍ民ＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＳＩＲＴ２邋ｉ打邋ｂｏｎｅ邋ｍａｒｒｏｗ邋ｍｏ打０打ｕｃｎｏｓｅｄ邋ＡＭＬ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ａ打ｄ邋ｒｄａｐｓｅ邋ＡＭＬ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ｗａｓ邋ｄｅｔｅｃｋｄ邋ＰＣ民．Ｅａｃｈ邋ｖａｌｕｅ邋ｉｎｄｉｃａｋｄ邋ｔｈｅ邋ｍｅａｎｉＳＤ邋ｏｆ邋ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ邋ｉｎ邋ａｎr>尸＜０．００１，ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗ地邋ｃｏｎｔｒｏｌ．逡逑在ＡＭＬ细胞系中的表达逡逑胞和ＨＬ６０／Ａ细胞中Ｓ化Ｔ２ｍ民ＮＡ水平的表达逡逑示ＳＩＲＴ２可能参与ＡＭＬ的多药耐药现象的发生，为了进一药耐药现象中的作用及其可能的作用机制，我们选取了对药胞系ＨＬ６０和相应的具有一定耐药性的ＨＬ６０／Ａ细胞株进行量ＰＣＲ方法检测ＳＩＲＴ２邋ｍＲＮＡ在ＨＬ６０细胞和ＨＬ６０／Ａ细胞明ＳＩＲＴ２在耐药细胞株化６０／Ａ中的表达量高于化６０细胞（b6＜0．0１）。逡逑＜逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.71

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本文编号：2521407