Bcl-2家族抑制剂Sabutoclax对乳腺癌多药耐药细胞抑制作用及其机制研究

发布时间：2019-08-20 13:31

【摘要】：研究目的:1.研究Bcl-2家族抑制剂Sabutoclax(Sab)对于多种人类乳腺癌敏感细胞系和耐药细胞系的杀伤作用,探讨Sab对于乳腺癌耐药细胞的抑制增殖及诱导凋亡作用。2.研究Sab对耐药乳腺癌干细胞的杀伤作用,进一步探索Sab克服乳腺癌耐药的作用机制。3.泛Bcl-2家族抑制剂Sab联合常规化疗药物多柔比星(DOX)/依托泊苷(VP-16),研究联合用药对于乳腺癌化疗耐药细胞的协同抑制作用。研究方法:1.使用细胞增殖实验(MTT)方法,比较Sab及多种传统化疗药物对化疗敏感的乳腺癌细胞系及其相对应的耐药细胞系之间的药物敏感性差异;通过平板克隆形成实验,评价Sab对乳腺癌敏感细胞系MCF-7及Cal51和多药耐药细胞系MCF-7/A02及CALDOX的长效敏感性差异。2.通过Annexin V/PI染色法检测Sab和依托泊苷对敏感及耐药乳腺癌细胞的凋亡诱导作用;利用Caspase-3/7活性检测以及Caspase-9检测法检测Sab对耐药乳腺癌细胞早期凋亡的诱导作用;使用实时定量PCR法检测耐药细胞系中Sab处理前后凋亡通路相关基因的m RNA水平变化;采用Western blotting检测不同细胞系中抗凋亡信号转导通路活性及Sab处理后凋亡相关蛋白的表达改变,诱导耐药细胞凋亡的IL-6/STAT3信号通路活性变化。3.采用实时定量PCR法检测耐药细胞系在Sab处理前后干细胞相关标志物m RNA水平变化;采用流式细胞仪检测Sab处理前后乳腺癌耐药细胞系MCF-7/A02和CALDOX中干样细胞CD44+/CD24-及ALDH+比例变化。4.利用球囊培养技术与软琼脂克隆形成实验检测耐药细胞系MCF-7/A02和CALDOX经Sab处理后,干细胞比例与增殖能力变化。5.采用免疫组化方法检测乳腺癌患者肿瘤组织离体后,在体外经Sab处理后,信号转导通路活性及相关凋亡蛋白的改变。6.利用MTT方法检测Sab联合多柔比星/依托泊苷对乳腺癌耐药细胞系的作用,运用Calcusyn软件,计算药物联合指数(combination index,CI)以明确双药联合是否均有协同增效作用;通过平板克隆形成实验,评价Sab联合多柔比星对乳腺癌耐药细胞系MCF-7/A02及CALDOX的协同抑制作用。通过Annexin V/PI染色法检测Sab联合VP16对耐药乳腺癌细胞的凋亡诱导作用。结果:1.以乳腺癌敏感细胞系MCF-7和Cal51以及相对应耐药细胞系MCF-7/A02和CALDOX为研究对象,MTT实验结果显示Sab对于敏感及耐药细胞系均具有明显抑制作用,且抑制作用呈浓度依赖性。耐药指数仅为1.6~3.3之间,而多柔比星等常规细胞毒性化疗药物的耐药指数约40~60,远高于Sab。平板克隆形成实验结果表明,多柔比星对于耐药细胞抑制作用较差,而Sab对于上述4种细胞均具有长效抑制作用,可有效抑制耐药细胞的增殖能力。2.通过Annexin V/PI染色法检测显示细胞毒性化疗药物依托泊苷可诱导乳腺癌敏感细胞凋亡,而相同剂量下耐药细胞系则表现为耐受,凋亡变化不显著。相同剂量Sab对乳腺癌敏感及耐药细胞系均具有诱导凋亡作用。Caspase-3/7活性检测以及Caspase-9检测法表明小于半数抑制率剂量的Sab即可诱导乳腺癌耐药细胞凋亡并呈浓度依赖性。PCR结果显示在m RNA水平上,凋亡相关基因Bim和Bax的m RNA水平明显升高,Sab高剂量组降低更明显,survivin的m RNA水平明显下降;Western blotting结果显示在蛋白水平,Bim、Bax,PUMA表达水平升高,survivin表达下降。免疫组化结果显示经Sab处理后,凋亡相关指标survivin表达水平下降,而Bax表达水平升高。3.PCR结果显示在m RNA水平上,CD44,ALDH和ABCG2表达水平显著下降,CD24的m RNA水平未见明显变化。乳腺癌细胞系干细胞亚群分析发现,相较于乳腺癌敏感细胞,耐药细胞系MCF-7/A02和CALDOX中CD44+/CD24-及ALDH+细胞的比例明显增高。给予耐药细胞系Sab处理后,CD44+/CD24-及ALDH+细胞的比例下降,并呈剂量依赖性。免疫组化结果显示经Sab处理后,干细胞标志物CD44及ALDH表达水平下降,p AKT及p STAT3经Sab处理后表达水平下降,即IL-6/STAT3信号转导通路活性受抑制。4.悬浮细胞球囊培养和软琼脂克隆实验证实耐药细胞球囊形成能力及体外成瘤能力较敏感细胞更高,Sab对MCF-7/A02和CALDOX细胞系干细胞体外成瘤能力和球囊形成能力均有抑制作用,亦呈剂量依赖性。5.通过Sab联合化疗药物在乳腺癌耐药细胞系中的作用研究中提示,Sab联合多柔比星/依托泊苷对乳腺癌耐药细胞系具有协同增效作用。结论:1.Sab可有效抑制乳腺癌耐药细胞生长增殖,促进肿瘤细胞凋亡。2.Sab增加促凋亡蛋白Bax和Bim表达,降低抗凋亡蛋白survivin表达进而实现其促进凋亡影响乳腺癌细胞的多药耐药的功能。3.Sab可有效抑制耐药细胞系中乳腺癌干细胞的比例,从而抑制耐药细胞的增殖以及成瘤能力。4.Bcl-2家族抑制剂Sab可以克服肿瘤细胞耐药,与常规细胞毒性化疗药物联合应用具有协同增效作用。
【图文】：

图 1.2 Sab 和 DOX 对乳腺癌敏感和耐药细胞克隆形成能力的抑制作用1.2.2 Sab 诱导乳腺癌耐药细胞凋亡首先我们利用Annexin V/PI染色法检测Sab对乳腺癌耐药细胞的凋亡诱导作用。结果显示敏感细胞 MCF-7 和耐药细胞 MCF-7/A02 在接受相同剂量依托泊苷40μM 处理后，MCF-7 细胞凋亡明显，凋亡细胞占总细胞数的 63.3%，而MCF-7/A02 细胞仅占 17.9%；Cal51 和 CALDOX 接受依托泊苷 10μM 处理后凋亡细胞分别为 26.6%和 5.7%（图 1.3.1）。可见，依托泊苷可以诱导敏感乳腺癌细胞凋亡，而对耐药细胞凋亡诱导作用较低。不同的是 MCF-7 和 MCF-7/A02 细胞给予 Sab 10μM 处理 24 小时后，凋亡细胞比例分别占 25.8%和 18.3%，可见对于敏感及耐药细胞均具有抑制作用。Cal51 和 CALDOX 接受 Sab 5μM 处理后，凋亡细胞分别占 23.4%和 20.4%。总之，Sab 可以诱导乳腺癌敏感和耐药细胞凋亡，与传统化疗药物相比，对耐药细胞较为敏感（图 1.3.1）。

图 1.3.1 Sab 及依托泊苷对乳腺癌耐药细胞凋亡的诱导作用为了进一步验证 Annexin V/PI 染色法结果，我们在耐药细胞中进行 caspase3/7 活性和 caspase 9 活性的检测。结果显示，给予不同浓度 Sab 处理耐药细胞MCF-7/A02 和 CALDOX 后，，caspase 3/7 活性和 caspase 9 活性增加，且随着剂量增加活性增强。caspase 3/7和caspase 9活性检测进一步验证了Sab通过caspase途径诱导乳腺癌耐药细胞凋亡（图 1.3.2）。图 1.3.2 Sab 对乳腺癌耐药细胞诱导凋亡的 caspase 活性影响1.2.3 Sab 可阻断凋亡信号通路诱导乳腺癌耐药细胞凋亡
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.9

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本文编号：2528660