miR-9靶向调控NRP1增强A549细胞放射敏感性的研究

发布时间：2019-08-27 18:39

【摘要】：在所有的实体瘤中肺癌的死亡率最高，生存率最低，是男性癌症死亡的主要原因，是女性癌症死亡的第二大原因。一般来说，肺癌可以分为两种主要的类型：小细胞肺癌和非小细胞肺癌（NSCLC）。其中，NSCLC大约占到80%。随着工业化速度加快、环境污染加重、人口老龄化加剧，肺癌的癌症负担日益加重。因此，肺癌的预防和治疗已经成为医学界亟待解决的问题。放射治疗是肺癌治疗的有效手段，在国内外已被广泛研究和应用。与小细胞肺癌相比，NSCLC对放疗更易产生耐受，因此提高非小细胞肺癌的辐射敏感性是目前急需解决的问题，与此同时分子靶向治疗在肺癌治疗上取得了重大突破。然而，miR-9在非小细胞肺癌中的临床意义尚不清楚。Himanshu等的研究表明，从H1299细胞照射后的表达谱不难发现，miR-9在受到电离辐射后表达水平降低。同时该研究也发现，miR-9可以通过靶向调控NF-κB1提高肺癌细胞的辐射敏感性。NRP1是一种跨膜糖蛋白，在多种肿瘤细胞上高表达，且与肿瘤的恶性度呈正相关。生物信息学分析显示，miR-9和NRP1具有靶向关系，而NRP1是一辐射抗性基因可引起肿瘤细胞的辐射抵抗。miR-9能否靶向调控NRP1提高A549细胞的辐射敏感性？有待于进一步探讨。本研究采用双荧光素酶报告基因实验、Western-blot、qRT-PCR、克隆形成和Transwell等实验方法探讨miR-9与NRP1的靶向关系以及miR-9增强A549细胞放射敏感性的分子机制。首先，双荧光素酶报告基因实验证实，过表达miR-9可以靶向调控NRP1，在mRNA以及蛋白水平上可以抑制NRP1的表达。其次，通过瞬时转染miR-9过表达细胞模型从细胞增殖、细胞周期、凋亡、侵袭能力、克隆形成等方面检测miR-9靶向调控NRP1增强A549细胞的辐射敏感性的各种指标。最后，探讨miR-9增强A549细胞辐射敏感性的信号通路机制。结果显示，miR-9可以抑制A549细胞的增殖以及迁移、侵袭能力，并通过PI3KⅠ-AKT、MARK-ERK、P38、NF-κB等多条信号传导通路发挥作用，提高A549细胞的放射敏感性。本研究通过探讨miR-9对A549细胞射敏感性方面的影响，阐明其可能的信号通路机理，期望为提高非小细胞肺癌的放射治疗效果提供新的治疗靶点。
【图文】：

序列,靶基因,结合位点,产物纯化

图 3.1 miR-9 与靶基因 NRP1 结合位点及突变位点 1.2 pEZX-MT05-NRP1-3'UTR 质粒的构建我们以 A549 基因组 DNA 为模板，设计引物(含 Acc65I 和 Xhol 酶切)PCR 扩增 NRP1-3'UTR 片段 (2600bp) PCR 产物纯化后与 pEZX-MT05 同时cc65I 和 Xhol 双酶切、连接并定向克隆构建重组质粒。重组质ZX-MT05-NRP1-3'UTR 经 Acc65I 和 Xhol 双酶切后出现的小片段RP1-3'UTR 片段大小相当，经 DNA 测序鉴定与设计序列完全一致，说明重粒 pEZX-MT05-NRP1-3'UTR 构建成功。

序列,测序,质粒,产物纯化

图 3.1 miR-9 与靶基因 NRP1 结合位点及突变位点 3.1.2 pEZX-MT05-NRP1-3'UTR 质粒的构建我们以 A549 基因组 DNA 为模板，设计引物(含 Acc65I 和 Xhol 酶切位点)PCR 扩增 NRP1-3'UTR 片段 (2600bp) PCR 产物纯化后与 pEZX-MT05 同时行Acc65I 和 Xhol 双酶切、连接并定向克隆构建重组质粒。重组质粒pEZX-MT05-NRP1-3'UTR 经 Acc65I 和 Xhol 双酶切后出现的小片段与NRP1-3'UTR 片段大小相当，，经 DNA 测序鉴定与设计序列完全一致，说明重组质粒 pEZX-MT05-NRP1-3'UTR 构建成功。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2

【参考文献】