基于荧光标记功能核酸的乳腺癌检测及相关研究

发布时间：2019-08-28 13:23

【摘要】：乳腺癌是全世界的女性中发病率最高的癌症。早期检测可有效降低乳腺癌患者死亡率,然而由于当前缺乏有效的识别早期乳腺癌的肿瘤生物标志物,乳腺癌早期检测的手段的准确性还稍显不足。具有RNA剪切功能的荧光脱氧核酶(RFDs)是一种具有催化剪切RNA功能的DNA分子,可以通过与特定的靶标结合产生催化作用,并利用RNA的剪切产生增强的荧光信号。RFD分子可以通过指数富集的系统配体进化(SELEX)过程获得。本论文主要围绕与乳腺癌相关的荧光标记功能核酸,建立了针对乳腺癌及其相关分子的新型检测技术。主要结果如下:利用SELEX过程筛选出可以对乳腺癌细胞MDA-MB-231产生应答的RFD分子探针AAI2-5。该探针可以对低至0.5μg/mL的MDA-MB-231蛋白进行检测(相当于约5,000 cell/mL)。利用荧光偏振检测其Kd值为103.7±8.4μg/m L。利用蛋白酶解的方式证明其靶标为蛋白分子。分子筛截留蛋白实验确定其靶标蛋白分子量为50 kDa以上。胞质/胞核实验显示其靶标位于细胞质内。该探针可以对MDA-MB-231细胞与其他细胞系进行区分,包括正常细胞、其他类型的肿瘤细胞,甚至其他乳腺癌细胞亚型。此外,AAI2-5可以对90%以上的临床乳腺肿瘤组织样本产生应答。本实验首次实现了可检测肿瘤细胞的RFD分子的筛选,表明RFD今后在临床诊断和治疗中具有应用的潜力。利用SELEX过程筛选出特异性针对雌激素受体蛋白的RFD分子探针ER-3。这是第一个利用单纯蛋白通过体外筛选得到的RFD分子探针。接下来通过对不同二价离子、离子浓度、反应温度、反应体系pH及反应时间的优化,优化了该探针检测雌激素受体蛋白的反应条件。ER-3可对低至0.8μg/mL的ER蛋白产生催化作用,显示出了良好的灵敏度,有望通过进一步对实体病例样本的研究,向临床检测乳腺癌及乳腺癌分型上进一步发展。基于荧光核酸适配体及石墨烯建立了一种具有变构效应的ATP检测方法,通过利用核酸外切酶III的剪切产物来放大荧光信号,与其他未进行信号放大的基于石墨烯及ATP的核酸适配体检测方法相比,显著提高了ATP检测的灵敏度。实验证实该方法具有高度的特异性,不易受蛋白干扰,有望应用于实体生物样本的检测。
【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9;O657.3

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本文编号：2530174