MALAT-1激活Notch-1信号通路促进软骨肉瘤细胞增殖的分子机制研究

发布时间：2019-09-12 18:55

【摘要】：目的和意义软骨肉瘤(chondrosarcoma, CHS)是一种除骨肉瘤以外的骨骼主要恶性肿瘤,但其分子病理学机制仍不清楚。从病理学上分类,软骨肉瘤主要有四种：普通型软骨肉瘤、去分化软骨肉瘤、间叶型软骨肉瘤和透明细胞软骨肉瘤。普通型软骨肉瘤占软骨肉瘤的85%,对化疗和放疗极不敏感。目前手术切除仍然是软骨肉瘤的主要治疗方法,但因手术造成的患者残疾和功能不全会给患者带来严重的生活负担和心理阴影。因此寻找和发现新的治疗方法,使得软骨肉瘤患者得到更好的预后,是刻不容缓的事情。随着分子生物学技术的迅猛发展,分子靶向治疗成为研究热点,也将为治疗软骨肉瘤提供新的有效途径。因此寻找新的分子靶点,对软骨肉瘤的治疗将具有重要的意义。转移相关肺腺癌转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT-1)是一种从斑马鱼到人类的生物中都高度保守的核内长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)。MALAT-1可通过调控基因剪接、基因表达和细胞周期来发挥其生物学功能。MALAT-1最初在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者中被发现高表达,与高风险的肿瘤转移相关。随后,研究表明MALAT-1在多种癌症中高表达,如结肠癌、前列腺癌、乳腺癌和口腔鳞状细胞癌等。这些结果表明MALAT-1具有致癌作用。然而,目前关于MALAT-1在软骨肉瘤中的作用知之甚少。研究发现,各种促生存信号途径在生物过程中起着重要的作用。其中,作为一种新的肿瘤发生机制,Notch信号通路越来越受关注。然而,Notch信号通路在肿瘤的发展中可显现相反的作用,如可作为肿瘤原癌基因或抑癌基因、抑制终末分化或诱导终末分化等。到目前为止,有4种Notch受体和5种相应的配体在哺乳动物中被发现,受体为Notch 1-4,而配体包括Delta-like-1 、 Jagged-1、 delta-like-4、delta-like-3和Jagged-2。近年研究表明,Notch受体或配体在多种癌症中过表达,包括乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌等。近年来,在骨肉瘤细胞的凋亡过程中,发现了Notch信号通路的变化。根据软骨发育过程中Notch信号通路的功能作用,Notch-1可被认为是软骨祖细胞的分子标记物。然而,Notch信号通路在软骨肉瘤细胞中的分子调节机制尚不清楚。本研究首先在软骨肉瘤组织和细胞中,通过qRT-PCR方法检测MALAT-1的异常表达,然后调节MALAT-1表达以观察其对于软骨肉瘤细胞生物学特性的影响,最后结合分子生物学技术手段,证实MALAT-1可通过调节Notch信号通路发挥作用,阐明MALAT-1在软骨肉瘤发生发展中所扮演的角色及其发挥功能的分子机理,为深入理解软骨肉瘤发病的分子机制和寻找新的分子靶向治疗靶点奠定理论基础。材料和方法1.临床标本收集20例软骨肉瘤组织和相应20例癌旁正常组织均取自在江苏省苏北人民医院行软骨肉瘤切除手术的患者。病理类型：普通型17例,去分化型3例。组织学上他们均属于软骨肉瘤Ⅱ-Ⅲ级,其中有4例发生淋巴结转移。组织样本取出后即放入液氮速冻,并于15 min内保存至-80℃。本研究中,所有患者均签署知情同意书,且经江苏省苏北人民医院伦理委员会批准。2.细胞培养培养软骨肉瘤细胞CH2879、L835、JJ012和软骨细胞TC28a2的培养基：RPMI1640培养基,其中含10%胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100 ng/mL链霉素。培养条件：370C、5% CO2、湿度饱和的培养箱。待细胞生长至对数生长期时用于后续实验研究。3.载体构建(1) MALAT-1过表达载体pcDNA-MALAT-1:根据MALAT-1序列分析结果,设计合成MALAT-1的单链oligo,利用PCR反应将其插入T载体,并转入宿主菌中扩增。提取扩增的重组T载体,测序验证目的片段序列的正确性。将已验证的目的片段克隆到pcDNA3.1表达载体上,即可获得稳定过表达MALAT-1的重组载体pcDNA-MALAT-1。(2) Notch-1过表达载体pcDNA-MALAT-1:具体方法同上,根据Notch-1序列分析结果,设计合成含Notch-1的目的片段,获得可稳定过表达Notch-1的载体pcDNA-Notch-1。4.干扰序列合成根据MALAT-1和Notch-1的序列分析分别设计合成相应的干扰序列(siRNA-MALAT-1或siRNA-Notch-1),以及错配无序序列作为对照siRNA-control。5.细胞转染采用阳离子脂质体法,依照LipofectaminTM 2000试剂说明书,将重组表达载体或siRNA转染至相应的软骨肉瘤细胞,48 h后荧光显微镜观察转染效率,荧光定量PCR和Western blot检测目标分子(MALAT-1或Notch-1)的表达水平。6.荧光定量PCR用Trizol试剂抽提细胞和组织的总RNA,经逆转录试剂盒合成cDNA后,使用SYBR Green染料进行PCR扩增反应。以GAPDH表达水平作为内参,运用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达值。7. Western blotWestern blot用于检测Notch-1及其下游基因Hes-1、Hey-1和Hey-2的蛋白表达,以β-actin为对照。提取组织或细胞总蛋白,测定蛋白浓度且调整样品终浓度,用于SDS-PAGE电泳,随后进行湿法转膜、免疫学反应、显色反应,拍照记录。8.MTT检测细胞增殖取对数生长期的细胞,接种于96孔培养板中,向每孔加入浓度为5mg/mL的MTT溶液10μL,37℃继续孵育4 h后终止培养。1500 rpm离心10分钟后弃上清,每孔加入150μLDMSO。以空白对照孔调零,酶标仪上570 nm测定每孔的吸光度,根据公式计算细胞存活率。9. Biotin-RNA pull down实验采用Biotin-RNA pull down法检测MALAT-1与Notch-1的结合。体外合成生物素结合的MALAT-1及MALAT-1反义链的转录本(阴性对照)。将蛋白裂解液与磁珠混合得到共沉淀的蛋白,随后与生物素化的RNA在4℃孵育,加入磁珠室温孵育1h。 4℃,3000 rpm离心3分钟,弃上清,留磁珠。用结合液(含100mM NaCl)清洗5次,用于SDS-PAGE分析并银染,选取差异条带进行Western blot检测。10.放线菌酮体外作用实验用5 μg/mL的放线菌酮处理预培养的细胞,分别在作用3h、6h、9 h后收集细胞,Western blot检测Notch-1的蛋白表达水平。11.裸鼠成瘤实验分别将转染有si-MALAT-1或si-control的JJ012细胞,或转染有pcDNA-MALAT-1或pcDNA的CH2879细胞接种于裸鼠后背部皮下,接种细胞数约为1×105个/只,每组包括6只裸鼠。每隔2天用游标卡尺测量肿瘤的长短径,并根据公式计算肿瘤体积。12.数据分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。荧光定量PCR检测结果中各种细胞ΔCt值的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA);组间数据比较采用t检验。P小于0.05为差异有统计学意义。结果1.MALAT-1对软骨肉瘤细胞增殖的影响荧光定量结果显示,软骨肉瘤组织中MALAT-1水平是癌旁组织中的3.55倍,且差异具有显著性。在软骨肉瘤细胞系CH2879、L835、JJ012和对照软骨细胞TC28a2中,荧光定量结果显示MALAT-1在CH2879、L835和JJ012中的表达水平均高于TC28a2,且MALAT-1在JJ012细胞中的表达最高,是对照细胞中表达水平的4.05倍,而在CH2879中的表达相对较低,是对照细胞中表达水平的2.24倍。这些结果表明,MALAT-1确实在软骨肉瘤组织和细胞中存在异常表达,揭示MALAT-1对软骨肉瘤的发生和发展可能具有重要作用。为进一步探明MALAT-1在软骨肉瘤的发生和发展中的重要作用,我们检测了MALAT-1对软骨肉瘤细胞增殖的影响。构建MALAT-1过表达载体pcDNA-MALAT-1,并转染CH2879细胞,荧光定量PCR检测发现,与对照相比,在CH2879细胞中转染pcDNA-MALAT-1后,MALAT-1的表达增加了10.02倍,表示通过瞬时转染pcDNA-MALAT-1可有效上调MALAT-1的表达。MTT法检测发现,转染pcDNA-MALAT-1后,CH2879细胞的生长速度增加了94%,差异具有显著性。同时,我们还发现转染有si-MALAT-1的JJ012细胞的生长速度下降到51%,差异具有显著性(P0.001)。以上结果显示,过表达MALAT-1可显著增强软骨肉瘤细胞增殖能力,而干扰MALAT-1表达显著降低了软骨肉瘤细胞增殖能力。2. Notch-1信号通路在软骨肉瘤细胞中的表达Western blot分析检测发现,与癌旁组织相比,软骨肉瘤组织沉淀中Notch-1及其下游分子Hes-1、Hey-1和Hey-2的蛋白水平明显增加(P0.05)。提取软骨肉瘤细胞系CH2879、L835、JJ012和对照软骨细胞TC28a2中的总蛋白,Westernblot检测发现,与对照细胞TC28a2中的蛋白水平相比,Notch-1及其下游分子Hes-1、 Hey-1和Hey-2在软骨肉瘤细胞中的表达明显增加(P0.05),且在JJ012细胞中蛋白含量最高,而在CH2879细胞中蛋白含量相对较低。以上结果表明,Notch-1在软骨肉瘤组织和细胞中表达偏高,暗示其可能与软骨肉瘤的发生和发展有关。3. MALAT-1通过激活Notch-1信号通路促进软骨肉瘤细胞增殖为检测MALAT-1对Notch-1信号通路的影响,在转染有si-MALAT-1或对照si-control的软骨肉瘤细胞JJ012中检测Notch-1的表达,结果发现,干扰MALAT-1表达对Notch-1的mRNA水平无影响。但Western blot分析发现,干扰MALAT-1降低了Notch-1的蛋白表达水平,并下调了Notch-1下游分子Hes-1、Hey-1和Hey-2的蛋白表达水平。而过表达MALAT-1可增加CH2879细胞中Notch-1及其下游Hes-1、Hey-1和Hey-2的蛋白表达水平。为进一步检测MALAT-1对Notch-1蛋白表达的影响,我们将转染有si-MALAT-1或si-control的JJ012细胞,用5 μg/mL的放线菌酮处理细胞,用Western blot分析Notch-1的蛋白水平。结果发现,干扰MALAT-1进一步导致放线菌酮引起的Notch-1降解加速。Biotin-RNA pull-down试验是一种有效研究蛋白与RNA相互作用的试验方法,我们将经体外转录的各生物素标记RNABiotin-MALAT-1和Biotin-MALAT-1 antisense分别与细胞蛋白裂解液孵育,随后用链霉亲和素磁珠捕获复合物,经洗涤去除非特异性结合后,用SDS-PAGE电泳分析后银染。结果证实了MALAT-1可与Notch-1结合。以上结果表明,MALAT-1可通过与Notch-1的结合激活Notch-1信号通路。为检测过表达Notch-1和干扰MALAT-1表达对细胞存活率的影响,我们将软骨肉瘤细胞JJ012分为4组：(1) si-control; (2) si-MALAT-1; (3) si-MALAT-1+pcDNA; (4) si-MALAT-1+pcDNA-Notch-1。 MTT实验检测细胞存活率,结果发现,过表达Notch-1逆转干扰MALAT-1表达导致的细胞存活率下降。进一步将软骨肉瘤细胞CH2879分为4组:(1) pcDNA; (2) pcDNA-MALAT-1; (3)pcDNA-MALAT-1+si-control; (4) pcDNA-MALAT-1+si-Notch-1, MTT实验检测细胞存活率。实验表明,干扰Notch-1表达逆转过表达MALAT-1导致的细胞存活率增加。这些结果揭示,MALAT-1是通过激活Notch-1信号通路促进软骨肉瘤细胞增殖。4.在体研究MALAT-1对软骨肉瘤细胞增殖的影响建立软骨肉瘤细胞裸鼠移植瘤模型,在体研究MALAT-1对软骨肉瘤细胞成瘤能力的影响。将转染有si-MALAT-1或si-control的JJ012细胞,或转染有pcDNA-MALAT-1或pcDNA的CH2879细胞,接种裸鼠皮下,每组6只。结果发现,转染有si-MALAT-1的JJ012细胞所形成的肿瘤体积显著小于对照组(P0.01),表明抑制MALAT-1表达使细胞的成瘤速度显著减慢。而过表达MALAT-1使细胞的成瘤速度显著增加,所形成的肿瘤大小也显著增加。结论1. MALAT-1在软骨肉瘤组织和细胞株中表达上调。2. MALAT-1与软骨肉瘤的发病机制有关,其表达上调可促进软骨肉瘤细胞的体外增殖能力,揭示其促癌作用。3. Notch-1信号通路在软骨肉瘤组织和细胞株中表达上调。4.在软骨肉瘤细胞中,MALAT-1可通过与Notch-1的结合促进Notch-1信号通路的表达。5. MALAT-1是通过激活Notch-1信号通路促进软骨肉瘤细胞增殖。6. MALAT-1的表达失调影响癌细胞的体内成瘤能力。
【图文】：

软骨肉瘤,表达水平,软骨细胞

法对２０例软骨肉瘤组织中ＭＡＬＡＴ－１的表达水平与癌旁组织中的相比较，发现逡逑在软骨肉瘤组织中ＭＡＬＡＴ－１相对于ＧＡＰＤＨ的平均表达水平为３．５５４，，是癌旁逡逑组织中的３．５５倍，且差异具有显著性（Ｐ＜0．00ｌ，图１－０。逡逑＂３邋４逦＃？＇逡逑Ｍ逦ｉｌｌ逡逑＾逦Ｉ逡逑Ｉ＇Ｊ邋Ｉ逡逑／／逡逑图１－１软骨肉瘤组织与癌旁组织中ＭＡＬＡＴ－１的含量逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ打邋ｏｆ邋ＭＡＬＡＴ－１邋ｉｎ邋ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍ汪邋ｔｉｓｓｕｅ邋ａｎｄ邋ｃｏｎ任0１逡逑１．２．２巧光定量ＰＣＲ检现Ｕ软骨肉瘤细胞中ＭＡＬＡＴ－１的表达逡逑提取软骨肉瘤细胞系ＣＨ２８７９、Ｌ８３５、ＪＪ０１２和对照软骨细胞ＴＣ２８ａ２中的逡逑１９逡逑

软骨,表达水平,转染,阳离子脂质体

３种细胞株中的表达均高于内参基因ＧＡＰＤＨ。运用２－ＡＡＣｔ法对３种软骨肉瘤细逡逑胞株中ＭＡＬＡＴ－１的表达水平与对照软骨细胞ＴＣ２８ａ２相比较，发现ＭＡＬＡＴ－１逡逑在ＣＨ２８７９、Ｌ８３５和ＪＪ０１２中的表达水平均高于ＴＣ２８ａ２邋（图１－２），且ＭＡＬＡＴ－１逡逑在ＪＪ０１２细胞中的表达最高，是对照细胞中表达水平的４．０５倍，而在ＣＨ２８７９逡逑中的表达相对较低，是对照细胞中表达水平的２．２４倍。逡逑—Ｍｉ邋Ｓ邋广逡逑参逦？？逡逑进邋４邋－逡逑＜邋３逦？逦占■逡逑Ｉ逦ＩＩＩ逡逑ＴＣ２８ａ２邋Ｃ把８巧邋Ｌ８３５逦ＪＪ０１２逡逑图１－２软骨肉墙细胞中ＭＡＬＡＴ－１的含量逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＭＡＬＡＴ－１邋ｉｎ邋ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｎｄ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑１．２．３过表达ＭＡＬＡＴ－１对软骨肉瘤细胞增殖的影响逡逑为进一步研究ＭＡＬＡＴ－１对软骨肉瘤细胞增殖的影响，我们构建ＭＡＬＡＴ－１逡逑过表泣载体ｐｃＤＮＡ－ＭＡＬＡＴ－１，利用阳离子脂质体法将ｐｃＤＮＡ－ＭＡＬＡＴ－１或对逡逑照ｐｃＤＮＡ转染至软骨肉瘤细胞ＣＨ２８７９中，转染４８邋ｈ后，抽提细胞总ＲＮＡ，逡逑逆转录成ｃＤＮＡ，通过巧光定量Ｐ
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R738

【相似文献】