miR-517a-3p和miR-610对肺癌细胞增殖和侵袭能力的影响及其机制

发布时间：2019-09-26 20:12

【摘要】：肺癌是发病率和死亡率增长最快,对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高,男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位,女性发病率占第二位,死亡率占第二位,造成患者死亡的主要原因是肺癌很早就发生了远处转移。因此,有效地控制肺癌的侵袭转移已成为当前肺癌研究和治疗的重要课题和难题。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是一类长约22nt的非编码内源性小RNA,可以与基因m RNA的3’UTR区结合,起到在转录后水平调控基因表达的作用。通过与靶m RNA的互补配对在转录后水平调控基因表达,导致m RNA的降解或翻译抑制,控制哺乳类动物约30%的蛋白质编码基因活性。mi RNA与其靶m RNA分子组成了一个复杂的调控网络,参与包括细胞增殖、分化、凋亡、发育等多种生物学过程。研究显示,在多种肿瘤中mi RNA表达异常,可能与肿瘤的形成、细胞分化及凋亡有关,它们有的起癌基因作用,有的则起抑癌基因作用。已有研究发现多种mi RNA可通过不同的途径调控肺癌细胞的侵袭转移,如mi R-126、mi R-183和let-7可分别通过作用于其各自的靶基因调控肺癌细胞的增殖和迁移能力。因此,深入研究不同mi RNAs家族成员对肺癌的作用对于阐明mi RNAs在肺癌发生和发展中的机制具有重要意义。在前期研究工作中,我们应用mi RNA表达谱芯片检测了具有高低不同转移潜能的肺癌细胞株95D和95C细胞,芯片结果显示mi R-517a-3p在95D中高表达,mi R-610在95C中高表达。因此,在本研究中,我们将应用实时定量PCR方法,验证mi R-517a-3p和mi R-610在95D和95C细胞中的表达水平,并进一步探讨mi R-517a-3p和mi R-610对肺癌细胞增殖和侵袭的作用及其可能机制,为后续基于mi RNAs的肺癌临床生物治疗的新靶点开发提供实验依据。本研究目的、方法、结果及结论如下:目的:Micro RNAs(mi RNAs)是一种非编码的小分子RNA,在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用,mi RNAs对肺癌的作用及机制仍需进一步阐明。本研究探讨了mi R-517a-3p和mi R-610对肺癌细胞增殖和侵袭能力的作用及机制。方法:1、人肺癌细胞株95D和95C用含10%胎牛血清的RPMI 1640细胞培养液培养,将实验细胞分别分为mi R-517a-3p和mi R-610类似物转染组、抑制物转染组、类似物阴性对照转染组、抑制物阴性对照转染组、只加转染试剂的空白对照组;2、应用实时定量PCR法检测mi R-517a-3p和mi R-610在高低不同转移能力肺癌细胞95D、95C中的表达水平;3、脂质体2000介导分别转染mi R-517a-3p和mi R-610类似物和抑制物入95C和95D细胞,应用体外划痕实验检测mi R-517a-3p和mi R-610对于肺癌细胞侵袭的作用;4、Transwell实验检测mi R-517a-3p和mi R-610对于肺癌细胞侵袭的作用,实验分为基质胶铺板、细胞悬液制备、细胞接种、结果统计等步骤;5、应用CCK8实验法,向细胞悬液中加入CCK8,培养2h后测定450nm吸光度,检测mi R-517a-3p和mi R-610对于肺癌细胞生长的作用;6、应用Brd U掺入实验法,将Brd U作用于细胞,后经DNA变性、封闭、Bru D单抗及二抗孵育,检测mi R-517a-3p和mi R-610对于肺癌细胞生长的作用;7、生物信息学软件预测mi R-517a-3p和mi R-610潜在的靶基因,双荧光素酶报告基因验证mi R-517a-3p是否作用于FOXJ3 m RNA的3’UTR区预测靶位,同样方法验证mi R-610是否作用于GJA3 m RNA的3’UTR区预测靶位;8、Western blot法检测FOXJ3和GJA3蛋白分别在95C和95D细胞中的表达水平。结果:(一)mi R-517a-3p对肺癌细胞增殖和侵袭能力的影响1、实时定量PCR结果显示,mi R-517a-3p在95D细胞中的表达水平显著高于其在95C细胞中表达,是95C细胞中表达水平的7.49±0.17倍,该实验结果提示mi R-517a-3p在肺癌细胞中的高表达可能与肺癌细胞的高转移能力相关;2、体外划痕实验结果显示,95C细胞转染mi R-517a-3p类似物后划痕宽度显著减小,划痕愈合程度更高;95D细胞转染mi R-517a-3p抑制物后划痕宽度显著增大,划痕愈合程度降低。该实验结果表明,mi R-517a-3p可以促进肺癌细胞的迁移能力;3、Transwell实验结果显示,与对照组相比,95C细胞转染mi R-517a-3p类似物侵袭能力显著提高,95D细胞转染mi R-517a-3p抑制物侵袭能力显著降低。该实验结果表明,mi R-517a-3p可以促进肺癌细胞的侵袭能力;4、CCK-8实验结果显示,细胞转染mi R-517a-3p类似物后增殖能力变强,转染mi R-517a-3p抑制物后增殖能力减弱,其他三组增殖能力差异无显著差异。同时,细胞增殖能力改变在转染后3d-4d时表现最为明显。该实验结果表明,mi R-517a-3p可以促进肺癌细胞的增殖;5、Brd U渗入实验结果显示,95C细胞转染mi R-517a-3p类似物后增殖能力显著增强,95D细胞转染mi R-517a-3p抑制物后增殖能力显著减弱。同时,细胞增殖能力改变在转染后3d-4d时表现最为明显。该实验结果表明,mi R-517a-3p可以促进肺癌细胞的增殖;6、应用在线生物信息学预测软件mi Randa预测FOXJ3可能为mi R-517a-3p的靶基因。对mi R-517a-3p和FOXJ3的野生型结合位点进行定点突变,mi R-517a-3p类似物阴性对照和mi R-517a-3p类似物野生型FOXJ3共转染组的95C细胞荧光素酶活性显著下降,而突变型转染组中荧光素酶活性无显著变化。该实验结果表明,mi R-517a-3p可以直接调控FOXJ3基因;7、应用Western印迹方法检测FOXJ3蛋白表达水平变化,结果显示,与对照组相比,95C细胞转染mi R-517a-3p类似物后,FOXJ3蛋白表达水平显著降低,95D细胞转染mi R-517a-3p抑制物后,FOXJ3蛋白表达水平显著提高。该实验结果表明,mi R-517a-3p可能抑制FOXJ3蛋白的表达。(二)mi R-610对肺癌细胞增殖和侵袭能力的影响1、实时定量PCR结果显示,mi R-610在95C细胞中的表达水平显著高于其在95D细胞中表达,是95D细胞中表达水平的8.75±0.21倍,该实验结果提示mi R-610在肺癌细胞中的低表达可能与肺癌细胞的高转移能力相关;2、体外划痕实验结果显示,转染mi R-610抑制物组95C细胞划痕的宽度明显低于空白对照组和转染mi R-610抑制物对照组,划痕愈合程度更高。转染mi R-610类似物组95D细胞划痕的宽度明显高于空白对照组和转染mi R-610类似物对照组,划痕愈合程度降低。该实验结果表明,mi R-610可以抑制肺癌细胞的迁移能力;3、Transwell实验结果显示,与对照组相比,95C细胞转染mi R-610抑制物侵袭能力显著提高,95D细胞转染mi R-610类似物侵袭能力显著降低。该实验结果表明,mi R-610可以抑制肺癌细胞的侵袭能力;4、CCK-8实验结果显示,95C细胞转染mi R-610抑制物后增殖能力显高于空白对照组95C细胞,95D细胞转染mi R-610类似物后增殖能力明显低于空白对照组95D细胞。而转染mi R-610抑制物对照和mi R-610类似物对照组细胞的增殖能力较空白对照组细胞无明显改变。该实验结果表明,mi R-610可抑制肺癌细胞的增殖;5、Brd U渗入实验结果显示,转染mi R-610抑制物后95C细胞的增殖能力明显增强,空白对照组和转染mi R-610类似物组95D细胞的增殖细胞数分别为(68.75±4.28)%和(46.13±3.27)%,转染mi R-610类似物后95D细胞增殖能力明显降低。该实验结果表明,mi R-610可以抑制肺癌细胞的增殖;6、应用在线生物信息学预测软件mi Randa预测GJA3可能为mi R-610的靶基因。对mi R-610和GJA3的野生型结合位点进行定点突变,mi R-610类似物和野生型GJA3共转染组的95D细胞荧光素酶活性明显下降,而突变型转染组中荧光素酶活性无明显变化。该实验结果表明,mi R-610可以直接调控GJA3基因的表达;7、应用Western印迹方法检测GJA3蛋白表达水平变化,结果显示,转染mi R-610抑制物后,95C细胞中GJA3蛋白的表达水平明显提高,为空白对照组95C细胞的3.49倍。转染mi R-610类似物后,95D细胞中GJA3蛋白的表达水平明显降低,空白对照组95D细胞中GJA3蛋白的表达量为转染mi R-610类似物组的6.82倍。该实验结果表明,mi R-610可能抑制GJA3蛋白的表达。结论:mi R-517a-3p靶向FOXJ3基因促进人肺癌细胞的侵袭和增殖作用,mi R-610靶向GJA3基因抑制人肺癌细胞的侵袭和增殖作用。
【图文】：

Real time PCR 检测 95C 和 95D 细胞中 miR-517a-3p 的表注：图中 95C 细胞为基准，表达水平为 1.00，p<0.0117a-3p 对肺癌 95C 和 95D 细胞迁移能力的影响痕迁移实验是检测细胞迁移能力的一种方法，在 9

95C 细胞转染 miR-517a-3p 类似物后划痕宽度显著减小（p<0.01，图3.2），划痕愈合程度更高；95D 细胞转染 miR-517a-3p 抑制物后划痕宽度显著增大（p<0.01，图 3.3），划痕愈合程度降低。该实验结果表明，，miR-517a-3p 可以促进肺癌细胞的迁移能力。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

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本文编号：2542307