【摘要】：背景和目的:胃癌是我国高发的恶性肿瘤之一,胃癌的转移是导致病人预后不良和生存率差的主要因素,越来越多的证据表明,胃癌细胞侵袭转移与上皮-间质转化(EMT)密切相关。尾型同源盒转录因子2(CDX2)在决定胃上皮干细胞的分化进程中发挥至关重要的角色,CDX2表达阳性的胃癌术后生存率明显高于CDX2表达阴性患者,提示CDX2是胃上皮细胞分化和抑制胃癌发生的关键转录因子。我们预实验发现胃癌细胞上调CDX2表达后,应用miRNA芯片检测差异表达的miRNA,结果显示,miRNA-32上调倍数较高。有文献报道,miRNA-32在肺癌和口腔癌中起着抗癌基因的作用。我们的研究也发现上调miRNA-32表达可明显抑制人胃癌细胞SGC-7901的生长及侵袭能力。然而,CDX2是否直接调控miRNA-32表达而抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力?这一作用是否与胃癌细胞EMT有关?目前鲜有文献报道。本研究首先在胃癌患者术后组织标本中探讨CDX2和miRNA-32的表达与病人临床病理特征及其与胃癌患者预后的关系。随后,通过过表达或干扰表达CDX2后检测胃癌细胞中CDX2与miRNA-32表达的时-效关系,探讨CDX2调控miRNA-32表达后对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭等恶性行为及EMT表型的影响。最后,在裸鼠皮下胃癌移植瘤模型中进一步验证CDX2调控miRNA-32表达对人胃癌裸鼠皮下移植瘤的影响及其对EMT的作用。方法:1.免疫组织化学技术检测60例胃癌患者术后石蜡切片标本中CDX2蛋白的表达,分析其与临床病理特征的关系,随访患者生存资料,分析CDX2表达对患者术后复发和生存期等预后的影响;应用实时荧光定量(RT)-PCR检测50例胃癌患者术后新鲜冰冻组织中CDX2 m RNA和miRNA-32表达,分析两者与胃癌临床病理特征之间的关系,同时分析cdx2和mirna-32之间的相关性,探讨其临床意义。2.rt-pcr和westernblot检测三株胃癌细胞中cdx2的内源性表达。设计空质粒组(对照组)、过表达cdx2组(pegfp-n1-cdx2真核表达质粒转染mkn-45细胞)、过表达cdx2和干扰mir-32组(cdx2真核表达质粒和mir-32inhibitor共同转染mkn-45细胞);干扰cdx2组(cdx2-shrna质粒转染ags细胞)和干扰表达cdx2和上调mirna-32组(cdx2shrna和mir-32mimic共同转染ags细胞)为研究对象。应用脂质体法分别将高表达cdx2质粒、mir-32inhibitor质粒、干扰表达cdx2质粒、mir-32mimic质粒和空质粒转染相应胃癌细胞株,应用rt-pcr法检测各组细胞在不同时间点cdx2mrna及mirna-32的动态表达变化,染色质免疫沉淀(chip)检测cdx2与mirna-32基因启动子的相互作用位点;应用cck-8法、克隆形成实验检测各组细胞增殖能力,划痕试验检测各组细胞迁移能力,transwell小室侵袭实验检测各组细胞侵袭能力。westernblot法检测各组细胞上皮-间质标志物e-cadherin和vimentin蛋白水平变化。3.设计空质粒对照组(空质粒转染mkn-45细胞)、过表达cdx2组(pegfp-n1-cdx2真核表达质粒转染mkn-45细胞)、干扰表达cdx2组(cdx2-shrna质粒转染mkn-45细胞)、过表达cdx2和干扰mirna-32组(cdx2真核表达质粒和mir-32inhibitor共同转染mkn-45细胞)为研究对象,建立人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型。观察并比较裸鼠的一般情况、肿瘤的生长情况,描绘生长曲线,计算抑瘤率,he染色观察肿瘤细胞的形态变化,免疫组织化学法检测移植瘤组织中cdx2蛋白的表达,rt-pcr检测移植瘤组织cdx2mrna、mirna-32表达水平,westernblot检测移植瘤组织中cdx2、e-cadherin和vimentin蛋白水平变化。结果:1.免疫组化染色结果提示,在胃癌细胞中cdx2阳性信号主要位于细胞核中,在胃癌组织中cdx2蛋白总体阳性表达率为35/60(58.3%),其中Ⅰ~Ⅱ期和无淋巴结转移的患者cdx2阳性表达水平较Ⅲ~Ⅳ期和淋巴结转移的患者阳性率高(p0.05)。cdx2阳性患者术后1~5年的累计复发率分别为20.0%、45.7%、71.4%、82.8%和91.4%,而cdx2阴性者手术后1~5年的累计肿瘤复发率分别为40.0%、80.0%、96.0%、100.0%和100.0%,且cdx2阴性患者术后中位复发时间明显短于cdx2阳性患者,两组手术后2~4年的累计肿瘤复发率、1~5年中位复发时间和总体生存期比较均有显著性差异(均p0.05)。rt-pcr检测结果提示,cdx2mrna和mirna-32表达与胃癌浸润深度、胃癌tmn分期、淋巴转移有关(p0.05),与肿瘤的分化程度、性别、年龄、肿瘤大小无关(p0.05)。相关性分析提示,胃癌组织中cdx2mrna和mirna-32表达呈显著正相关(r=0.861,p0.05)。2.胃癌细胞中cdx2内源性表达水平依次为agsmkn-45sgc-7901。过表达或干扰cdx2表达后,在0、24、48、72h时间点,mir-32的表达随cdx2表达的升高而升高,降低而降低(均p0.05);chip检测提示,mnk-45和ags细胞中cdx2抗体能够特异性结合部分mirna-32基因启动子的引物对应区。上调cdx2诱导mirna-32表达后,能够抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力(p0.05),然而过表达cdx2后应用mir-32inhibitor下调mirna-32表达,这种抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭作用减弱,与对照组比较无统计学意义(p0.05);干扰cdx2表达抑制mirna-32表达后,具有促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力(p0.05),同样干扰cdx2后应用mir-32mimic上调mirna-32表达,促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭作用也出现减弱,与对照组比较无统计学意义(p0.05)。随后,westernblot检测发现,cdx2表达上调时e-cadherin蛋白表达升高、vimentin蛋白表达减少,而cdx2表达下调时e-cadherin蛋白表达下降、vimentin蛋白表达增高,但分别应用mir-32inhibitor和mir-32mimic进行干预后,e-cadherin和vimentin蛋白动态变化又出现逆转。3.选择cdx2中等表达水平的mkn-45细胞株,成功建立了人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型。过表达cdx2组成瘤率为80%,干扰cdx2组成瘤率为60%,空载及共转组(过表达cdx2和干扰mir-32组)均为100%。4组相比较,干扰cdx2组肿瘤的成瘤时间、生长速度均明显快于其他三组,体积和质量也较另三组明显增大(p0.05)。相反,过表达cdx2组肿瘤的成瘤时间、生长速度均明显慢于其他三组,体积也较另三组明显减小(p0.05),抑瘤率为65.3%,而共转组与对照组比较,肿瘤的生长速度和体积无统计学意义(抑瘤率11.1%,p0.05)。rt-pcr检测结果提示,干扰cdx2组胃癌移植瘤cdx2mrna和mirna-32表达明显下调,而cdx2过表达组cdx2mrna和mirna-32表达较对照组明显上调,两者在体内亦存在正相关。然而,共转组移植瘤组织中cdx2mrna表达明显上调,mirna-32的表达明显下调。Western blot检测结果显示,与对照组比较,干扰CDX2下调miRNA-32表达后,移植瘤组织中E-cadherin表达减低、Vimentin表达升高,而过表达CDX2上调miRNA-32表达后,移植瘤组织中E-cadherin表达上调、Vimentin表达降低,差异均有统计学意义(均P0.05)。而共转组与对照组比较,E-cadherin和Vimentin的表达变化无统计学意义。结论:1.胃癌患者术后组织标本中CDX2和miRNA-32表达下调与患者病情进展有关,CDX2蛋白阴性者预后更差,且更容易出现术后的短期复发。2.CDX2体外直接调控miRNA-32的转录,并影响胃癌细胞增殖、迁移、侵袭以及EMT表型等生物学行为。3.在裸鼠体内CDX2能正向调控miRNA-32表达影响胃癌移植瘤的生长并逆转胃癌EMT作用。
【图文】：
表达影响胃癌细胞增殖、迁移和侵袭作用及机制的初步研究 第一部分19图1-2 CDX2蛋白阳性表达患者与阴性表达患者生存曲线比较注：1指CDX2阳性表达患者；2指CDX2阴性表达患者3.4胃癌组织中CDX2 mRNA和miR-32表达与其临床病理特征的关系50例胃癌组织中CDX2 mRNA和miR-32表达水平显著高于远癌胃组织，差异有统计学意义（分别为4.13±1.68 VS 0.23±0.06，0.39±0.08 VS 0.11±0.02，P均<0.05）。进一步发现，胃癌组织CDX2 mRNA和miR-32的表达均与胃癌浸润深度、胃癌的TNM分期和淋巴转移有关，在未侵及浆膜、Ⅰ~Ⅱ期和无淋巴结转移的胃癌组织中高表达，，侵及浆膜、Ⅲ~Ⅳ期和有淋巴结转移者低表达，差异均具有统计学意义（P均<0.05）
胃癌组织中CDX2mRNA和miR-32表达的相关性散点图
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
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