TRIM31在肝细胞肝癌转移与肿瘤进展中的作用与分子机制

发布时间：2020-01-23 17:39

【摘要】：研究目的TRIM31 (tripartite motif-containing protein 31)是TRIM家族的一个成员。TRIM31由三个结构域组成,分别是Ring结构域,B-box结构域和coiled-coil结构域。由于Ring结构域的存在,TRIM家族成员大都具有E3泛素酶的活性。之前研究发现,TRIM家族成员能够参与一系列机体的生理及病理过程,包括细胞生长、凋亡、转录调节及肿瘤形成等。然而,TRIM家族成员在肝细胞肝癌中的研究较少,TRIM 31与肿瘤的关系,仅在胃癌和非小细胞肺癌中有研究,在肝癌及其它恶性肿瘤中并无相关研究报道。本课题旨在阐明TRIM31在肝细胞肝癌转移和肿瘤进展中的作用及相关分子机制。第一部分TRIM31在肝细胞肝癌恶性转移中的作用及机制肿瘤转移是一个多步骤的过程。正常上皮细胞脱离细胞外基质附着后会诱发凋亡,即“失巢凋亡”；而恶性肿瘤细胞获得了抵抗失巢凋亡的能力,进入脉管系统后能够以锚定非依赖性的方式存活,是肿瘤转移的重要前提。本部分研究旨在阐明TRIM31在肝癌细胞抵抗失巢凋亡过程中的表达状况、作用效应及其分子机制,为阐明肝癌细胞抵抗失巢凋亡并进一步侵袭转移的分子机制和对其进行靶向逆转奠定基础。材料方法1.建立脱离附着的细胞模型1.1为模拟肝癌细胞在体内原位生长以及脱离细胞外基质附着继续存活的状态,我们在体外将肝癌细胞接种于2-羟乙基甲基丙烯酸酯(poly-HEMA)覆盖的培养板中,由此建立了肝癌细胞的失巢模型。1.2 Real-time PCR及Western blot方法检测TRIM31在贴壁生长及失巢后的肝癌细胞中的表达差异。2. TRIM31对肝癌细胞抵抗失巢凋亡的影响培养细胞至指数生长期,用靶向TRIM31的SiRNA (Si-TRIM31)转染肝癌细胞,并以无关序列做对照。构建肝癌细胞失巢模型,用CCK-8法检测干扰TRIM31后对肝癌细胞抵抗失巢凋亡效应的影响。分别应用Transwell实验和克隆形成实验检测干扰TRIM31后对失巢后的肝癌细胞的侵袭转移力和克隆形成能力的影响。3. TRIM31发挥作用的信号通路及分子靶点检测3.1培养细胞至指数生长期,用靶向TRIM31的SiRNA (Si-TRIM31)专染肝癌细胞,并以无关序列做对照。建立失巢的细胞模型,继续培养24h后进行蛋白提取。用Western Blot方法检测细胞凋亡情况及凋亡通路变化。3.2应用免疫共沉淀和Western blot等方法检测TRIM31发挥作用的分子靶点及其机制。实验结果1. TRIM31在失巢后的肝癌细胞中表达上调且介导肝癌细胞对失巢凋亡抵抗效应1.1 TRIM31在失巢后的肝癌细胞中表达上调用Real-time PCR及Western blot方法检测结果显示,与贴壁生长的肝癌细胞相比,TRIM31的mRNA水平及蛋白水平在失巢后的肝癌细胞中表达显著上调。1.2 TRIM31介导肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应将肝癌细胞接种于普通六孔板中,转染TRIM31小干扰RNA(Si-TRIM31),并以转染无关序列(Si-NC)组作为对照。经过Real-time PCR及Western blot验证,靶向TRIM31的Si-TRIM31能够显著性抑制TRIM31的表达水平。1.2.1 TRIM31介导了肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗我们应用CCK-8实验对失巢后肝癌细胞的存活能力进行了检测。结果显示,与对照组相比,Si-TRIM31转染组失巢后肝癌细胞的死亡率大大提高。该结果提不,TRIM31的表达被抑制后,肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗被显著逆转。进一步通过Western blot和Caspase-3剪切底物试剂盒对失巢后肝癌细胞的凋亡水平进行了检测,结果显示干扰TRIM31表达后,失巢后的肝癌细胞发生明显的凋亡反应。该结果提示,TRIM31介导了肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应。1.2.2 TRIM31参与介导了失巢后的肝癌细胞的侵袭转移Transwell实验结果显示,与贴壁生长的肝癌细胞相比,失巢后的肝癌细胞侵袭转移力显著增强,而用小干扰RNA沉默TRIM31表达之后,穿过transwell上室膜的肝癌细胞明显减少,提示TRIM31参与介导了失巢后肝癌细胞的侵袭转移能力的增强。1.2.3 TRIM31参与介导了失巢后的肝癌细胞的克隆形成克隆形成实验结果显示,失巢后的肝癌细胞克隆形成能力显著增强,而用小干扰RNA沉默TRIM31的表达之后,失巢后的肝癌细胞的克隆形成能力明显减弱,提示TRIM31介导了失巢后肝癌细胞的克隆形成能力的增强2. TRIM31通过活化AMPK信号通路介导肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应2.1 AMPK通路的活化在肝癌细胞抵抗失巢凋亡中发挥重要作用培养细胞至指数生长期,构建失巢的肝癌细胞模型,利用Western blot实验进行信号通路筛选。Western blot结果显示,失巢后的肝癌细胞中,AMPK通路明显活化。应用AMPK信号通路的抑制剂Compound C对其进行封闭后,肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应、以及失巢后肝癌细胞的侵袭转移力和克隆形成能力都显著降低。提示AMPK通路的活化在肝癌细胞抵抗失巢凋亡中发挥重要作用。2.2 TRIM31通过活化AMPK信号通路介导肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应在前期证实AMPK通路在失巢后肝癌细胞活化的基础上,我们进一步检测了TRIM31介导的肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应是否通过AMPK通路的活化介导的。结果显示,Si-TRIM31转染组能够有效逆转失巢后肝癌细胞中AMPK通路的活化效应。而应用AMPK信号通路的抑制剂Compound C作用后,TRIM31所介导的肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应,以及失巢后肝癌细胞所增强的侵袭转移能力及克隆形成能力都得到了有效的逆转。这些结果提示,TRIM31所介导的肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应及相关的恶性行为是通过活化AMPK通路实现的。3. TRIM31通过直接靶向降解P53分子,介导肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应为了明确TRIM31的分子靶点,我们进行了免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)实验。实验结果显示,TRIM31能够直接结合并负向调控AMPK上游的P53分子,而进一步的免疫沉淀和Western blot结果显示,TRIM31能够通过Ring结构域对P53进行K48位泛素化降解而实现对其负向调控,并介导AMPK通路的活化和肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应。进一步研究显示,P53在失巢后肝癌中的外源性过表达,能够有效逆转TRIM31所介导的肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应。这些实验结果提示,TRIM31是肝癌细胞抵抗失巢凋亡的关键基因,为临床靶向TRIM31治疗转移性肝癌的治疗策略探索奠定了基础。结论1. TRIM31在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中表达上调,并能够通过活化AMPK通路介导肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应2. TRIM31能够直接结合和泛素化降解P53分子,进而活化AMPK通路并介导肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应,外源性过表达P53分子能够有效逆转TRIM31在肝癌细胞失巢凋亡抵抗中的作用。创新点及意义1.首次证实了TRIM31介导了肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应,为阐明肝癌的转移机制和对其进行靶向逆转奠定了基础。2.首次发现TRIM31对AMPK通路的调控效应,为逆转肝癌转移提供了新的分子靶点。3.首次发现p53基因是TRIM31的直接靶点,而TRIM31对P53的靶向降解介导了肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗,为肝癌转移机制的阐明和对其在分子水平进行早期干预奠定了基础。第二部分TRIM31在肝细胞肝癌发生与进展中的作用与分子机制肝细胞肝癌是全球范围内仅次于肺癌和胃癌的癌症第三大死因,而目前肝细胞肝癌的发生机理和进展机制尚不明确,对此问题的深入研究和探讨,将从分子水平阐明肝细胞肝癌的发生发展机制,对肝细胞肝癌的预防、靶向治疗及预后干预都具有重要意义。本部分旨在研究阐明TRIM31在肝细胞肝癌进展中的作用及相关分子机制。实验结果1. TRIM31在肝癌组织中表达显著上调并参与肝癌的进展1.1 TRIM31在肝癌组织中表达显著上调1.1.1我们从山东省立医院收集了108对临床病人的肝癌组织及相应远端非癌肝组织,提取蛋白之后进行Western blot实验,实验结果显示与远端非癌肝组织相比,TRM31在肝癌组织中的表达显著上调。1.1.2为了验证Western blot的实验结果,我们另取104对临床病人的肝癌组织及远端非癌肝组织做石蜡切片进行免疫组合检测。实验结果显示,TRIM31主要表达在肝癌细胞的细胞质中,并且与远端非癌肝组织相比,肝癌组织中TRIM31染色较深,表明TRIM31在肝癌组织中表达上调。1.1.3 Spearman相关分析显示,TRIM31在肝癌组织中的表达水平与肝癌的肿瘤大小、临床分期及TNM分级呈显著正相关,提示TRIM31在肝癌组织中的表达上调可能参与促进了肝癌的进程。1.2 TRIM31参与促进了肝癌细胞的恶性行为在TRIM31基础表达量较低的肝癌细胞中转染TRIM31真核表达载体及相应空载体作对照,构建TRIM31过表达模型；同时在TRIM31基础表达量较高的肝癌细胞中转染TRIM31小干扰RNA及相应无关序列作对照,构建TRIM31表达沉默模型,通过CCK-8法检测细胞活力,transwell实验检测细胞侵袭转移能力,克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力。正反两方面的实验结果显示,TRIM31的过表达显著促进了肝癌细胞的细胞增殖、侵袭转移以及克隆形成能力；而TRIM31表达受到抑制之后,细胞的恶性行为均受到有效抑制。结果提示,TRIM31能够显著促进肝癌细胞恶性行为的进展。2. TRIM31通过活化mTORCl通路发挥对肝癌细胞恶性行为的促进作用2.1分别构建TRIM31过表达及干扰表达的肝癌细胞模型,应用Western blot检测细胞模型中信号通路的活化状况。Western blot结果显示,TRIM31能够明显活化mTORC1通路以及下游分子S6K1,S6,及HIF-1α,提示TRIM31能够显著促进mTORC1通路的活化。2.2应用mTORC1通路的特异性抑制剂雷帕霉素对肝癌细胞进行预处理后,将TRIM31表达质粒转染肝癌细胞以构建TRIM31过表达的肝癌模型。Western blot结果证实nTORC1通路能够被雷帕霉素有效封闭,而进一步的实验显示,mTORC1通路被抑制之后,TRIM31对肝癌细胞的恶性行为进展促进作用也被有效抑制。这些结果提示,TRIM31对肝癌细胞恶性行为的促进效应是通过mTORC1通路的活化所介导的。3. TRIM31在肝癌细胞中通过直接靶向结合并降解TSC1和TSC2发挥效应3.1 TRIM31通过靶向降解TSC1和TSC2发挥促癌作用3.1.1分别构建TRIM31过表达及干扰表达的肝癌细胞模型,应用Western blot检测TRIM31对mTORC1上游的负向调控分子,TSC1-TSC2复合体的表达调控。实验结果显示,TRIM31的过表达能够抑制TSC1及TSC2的表达,而抑制TRIM31的表达之后,TSC1及TSC2的表达上调。同时应用蛋白酶体抑制剂MG132之后,TRIM31对TSC1和TSC2的负向调控效应消失,提示TRIM31对TSC1-TSC2的负向调控效应是通过蛋白酶体途径介导的。TRIM31的Ring结构域缺失突变体(FLAG-TRIM31-C58)和点突变体(FLAG-TRIM31-36A)均没有对TSC1和TSC2的负向调控效应。这些实验结果提示,TRIM31可以通过Ring结构域发挥对TSC1及TSC2的负向调控效应。3.1.2免疫共沉淀实验结果显示,TRIM31能够直接靶向结合TSC1及TSC2。同时TRIM31通过Ring结构域对TSC1和TSC2进行K48位泛素化修饰。IP实验和Western blot的实验结果进一步证实,TRIM31能够与TSC1和TSC2直接结合,并通过Ring结构域介导对其进行K48位泛素化修饰降解。这些结果提示,TSC1和TSC2是TR1M31发挥对肝癌细胞中mTORC1通路抑制效应的分子靶点。3.2 TSC1和TSC2的外源性过表达能够逆转TR I M31的促癌作用在肝癌细胞中进行TRIM31、TSC1和/或TSC2的共转染之后,检测细胞生物学活性检测,并以空载体转染组作为对照。实验结果显示,TSC1和/或TSC2的过表达能够有效逆转TRIM31对肝癌细胞的增殖能力、克隆形成能力和侵袭转移能力等一系列恶性行为的促进效应。这些实验结果提示,TRIM31发挥促癌作用是通过其对TSC1-TSC2复合体的直接靶向泛素化降解而实现的。结论1.TRIM31在肝癌组织中的表达显著上调,并且TRIM31的表达与肿瘤大小、临床分期、病理分级呈正相关。提示TRIM31在肝癌组织中的过表达促进了肝癌的进展。2.TRIM31对肝癌恶性行为的促进效应是通过其活化mTORC1通路实现的。3. TRIM31能够直接靶向TSC1-TSC2复合体,并对其进行泛素化降解,进而激活mTORC1通路,促进肝癌的恶性行为。创新点及意义1.本课题首次在临床肝癌组织标本中检测了TRIM31的表达,并分析了其与临床指标的相关性,揭示了TRIM31在肝癌发生发展中的重要促进作用,为其在肿瘤免疫领域的进一步研究提供了新思路。2.本课题首次发现TRIM31对mTORC1信号通路的活化效应,为阐明]TRIM31发挥效应的分子机制奠定了基础。3.本研究首次揭示TRIM31能够直接靶向TSC1-TSC2复合体并对其进行泛素化降解,进而解除其对mTORC1通路的抑制效应,活化该通路并促进肝癌的进程,为肝癌发生发展机制的阐明和对其进行早期干预奠定了基础。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

【相似文献】