人工设计的干扰性LncRNAi竞争性消耗Onco-miRNAs发挥抗肝癌疗效的实验研究

发布时间：2020-01-23 23:12

【摘要】：【研究背景和目的】近来生物信息学分析表明,人类相当数量的基因受microRNAs(miRNAs)的调控,miRNAs在多种生物的生命进程中起到关键作用。与正常组织相比,肿瘤组织中的miRNAs表达谱发生变化,说明肿瘤的发生发展与mi RNAs密切相关。在肿瘤组织中,mi RNAs充当着致癌性或抑癌性的角色,调控其靶基因的表达和功能,参与肿瘤发生发展的过程。其中肿瘤细胞内高表达的致癌性miRNAs(Oncogenic miRNAs,OncomiRs)会灭活一些抑癌基因。因此针对这些高表达的致癌性miRNAs的靶向治疗价值不可估量。目前,以miRNAs为靶点的肿瘤治疗方案很多,其中有采用miRNAs抑制剂或反义序列封闭miRNAs的表达。但现有的治疗大多针对单一的miRNA或其家族。由于miRNAs调控机制复杂,一个miRNA可能调控多个靶基因,而一个靶基因也可能受多个miRNAs调控,因此针对单一miRNA表达的干预对肿瘤的抑制效果很有限。我们设想在细胞内引入一条人工设计的干扰性长链非编码RNA(Interfering long non-coding RNA,LncRNAi),该LncRNAi同时包含能与多个OncomiRs种子序列互补结合的序列,能够与OncomiRs的靶基因mRNAs竞争结合OncomiRs,从而消耗细胞内高水平的OncomiRs,对Oncomi Rs的抑癌性靶基因起保护作用。但是,这样的竞争性保护作用,需要竞争者(即LncRNAi)的拷贝数要明显高于被竞争者(即OncomiRs)才能显现良好的效果。本研究利用我们前期构建并在实验中证实能够在肝癌中高拷贝增殖的溶瘤腺病毒载体,表达一种人工合成的LncRNAi。随腺病毒在癌细胞中复制,实现LncRNAi在癌细胞中的大量表达,竞争性消耗OncomiRs,从而实现对癌细胞的靶向干预治疗。【研究方法】1、腺病毒载体的构建及鉴定:以我们前期构建的survivin启动子调控的肿瘤特异性增殖腺病毒adsurp为载体,将12个在肝癌中高表达的oncomirs种子序列的互补序列(表1)串联起来并重复6个拷贝数后,作为编码lncrnai的基因序列,构建表达lncrnai的肿瘤特异性增殖腺病毒adsvpe1a-lncr。同时构建以绿色荧光蛋白报告基因(egfp)代替e1a的携带lncrnai的非增殖型阳性对照腺病毒adsvpegfp-lncr,并以前期构建的ad5-egfp为阴性对照腺病毒。2、细胞系培养:肝癌细胞系(hepg2、hep3b、smmc-7721、mhcc97h、mhcc97l、huh-7、plc/prf/5)和正常肝细胞系(l02、wrl-68)来源于中国科学院上海生命科学研究院细胞与生化研究所细胞库,按供应商提供的方法培养。3、基因表达检测:上述细胞系感染不同强度的实验腺病毒和对照腺病毒,提取细胞总蛋白,采用westernblot方法检测相应蛋白的表达。4、腺病毒特异性增殖活性的检测:上述细胞系以moi=1pfu/cell感染adsvpe1a-lncr,以adsvpegfp-lncr为对照,分别在0h、24h、48h、72h时间点收集细胞,tcid50方法检测病毒滴度。5、腺病毒介导的lncrnai表达检测:上述细胞系以moi=1pfu/cell感染adsvpe1a-lncr,以adsvpegfp-lncr为对照,常规rt-pcr以及实时定量rt-pcr(qrt-pcr)检测lncrnai的表达。6、细胞增殖活性检测:通过四唑盐比色实验(mtt法)检测病毒adsvpe1a-lncr对肝癌细胞和正常细胞增殖的影响,以adsvpegfp-lncr和ad5-egfp为对照。7、迁移与侵袭实验:上述细胞系以moi=1pfu/cell感染adsvpe1a-lncr,以adsvpegfp-lncr和ad5-egfp为病毒对照组,另设不加病毒的亲代细胞同步培养作为空白对照,transwell实验检测细胞迁移侵袭能力。8、细胞周期和凋亡:上述细胞系以moi=1pfu/cell感染adsvpe1a-lncr,以adsvpegfp-lncr和ad5-egfp为病毒对照组,另设不加病毒的亲代细胞同步培养作为空白对照,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。9、细胞蛋白表达谱变化的检测:huh-7细胞以moi=1pfu/cell的感染强度感染adsvpe1a-lncr,设ad5-egfp为阴性病毒对照,不加病毒的细胞同步培养作为空白对照。48h后,收集细胞,提取细胞总蛋白,基因表达谱芯片检测蛋白表达的变化。10、动物模型实验:构建小鼠肝癌移植瘤模型,实验病毒干预治疗后,观察记录肿瘤生长情况。【研究结果】1、肿瘤特异性增殖腺病毒在肝癌细胞中特异性增殖:本实验构建的表达lncrnai的肿瘤特异性增殖腺病毒adsvpe1a-lncr,以肿瘤高特异性的survivin启动子调控e1a表达,实现病毒的靶向特异性增殖。细胞感染adsvpe1a-lncr后,westernblot检测发现肝癌细胞表现为不同程度的survivin阳性表达,而正常肝细胞wrl-68、l02为survivin阴性表达。腺病毒e1a在肝癌细胞中的阳性表达程度与survivin表达水平相一致,adsvpe1a-lncr在部分survivin高表达的肝癌细胞中特异性增殖复制的能力非常强,最高达68465.66倍(huh-7),而在正常细胞l02、wrl-68中增殖不明显。2、肿瘤特异性增殖腺病毒在肝癌细胞中介导lncrnai的表达:adsvpe1a-lncr介导的lncrnai表达,qrt-pcr检测显示,adsvpe1a-lncr介导的lncrnai表达水平,在肝癌细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞。3、肿瘤特异性增殖腺病毒表达lncrnai对肝癌细胞增殖活性有抑制作用:adsvpe1a-lncr对hep3b和huh-7杀伤活性最强,hep3b存活率在moi=0.5pfu/cell时已下降到50%以下,在moi=2pfu/cell时已下降到10%以下;huh-7存活率在moi=1pfu/cell时已下降到50%以下,在moi=100pfu/cell时已下降到10%以下。adsvpe1a-lncr对其他肝癌细胞的杀伤也较强,而对正-4-常肝细胞生物增殖无明显影响。4、肿瘤特异性增殖腺病毒表达lncrnai对肝癌细胞运动能力有抑制作用:transwell细胞迁移和侵袭实验显示,与空白对照组相比,adsvpe1a-lncr对部分肝癌细胞的迁移侵袭能力有较强的抑制作用,其作用明显强于非增殖的对照腺病毒adsvpegfp-lncr。adsvpe1a-lncr和adsvpegfp-lncr对正常肝细胞的运动能力无明显抑制作用。5、肿瘤特异性增殖腺病毒表达lncrnai诱导细胞周期的变化:实验腺病毒adsvpe1a-lncr和对照腺病毒adsvpegfp-lncr、ad5-egfp对正常肝细胞周期各时相无明显作用,而对于肝癌细胞,adsvpe1a-lncr对细胞周期时相的变化因细胞不同而不同。plc/prf/5、hep3b、huh-7细胞表现为g0/g1期阻滞,而hepg2、mhcc97h细胞表现为s期阻滞。6、肿瘤特异性增殖腺病毒表达lncrnai诱导细胞发生凋亡:本组实验细胞在感染adsvpe1a-lncr后,均表现为细胞凋亡比例的升高,以hep3b、hepg2、plc/prf/5、huh-7细胞凋亡比例的升高最为明显,而bel-7402、wrl-68和l02细胞凋亡比例的升高无统计差异。实验细胞感染非增殖型对照腺病毒adsvpegfp-lncr后,其诱导细胞凋亡的活性较弱。7、肿瘤特异性增殖腺病毒表达lncrnai影响细胞蛋白的表达谱:huh-7和hepg2细胞感染adsvpe1a-lncr后,基因表达谱变化明显。检出708个基因表达升高,以抑癌基因表达升高为主(pten、p27kip1、timp3、reck);检出628个基因表达降低,以原癌基因表达降低为主(p38/mapk、survivin、cdk4、c-myc)。8、肿瘤特异性增殖腺病毒表达lncrnai对肝癌细胞裸鼠移植瘤有生长抑制作用:肝癌细胞huh-7裸鼠移植瘤成瘤后,adsvpe1a-lncr治疗组肿瘤生长速度明显低于空白对照组,治疗第42天adsvpe1a-lncr组瘤体体积明显低于治疗前;adsvpegfp-lncr治疗组在治疗后28天后也较空白对照组也出现一定程度的生长抑制,差别具有显著意义,但瘤体仍在持续增长中;ad5-EGFP组自始至终未出现生长抑制。【研究结论】以我们前期构建、并在实验中得到有效性验证的Survivin启动子调控的肿瘤特异性增殖腺病毒为载体,表达一种人工设计合成的干扰性长链非编码RNA(LncRNAi),该LncRNAi包含一组(12个)能够通过多种机制促进HCC癌细胞发生发展的Oncomi Rs的种子序列的互补结合序列,包括miR-21、mi R-221/222、miR-224、miR-17-5p、mi R-10b、miR106b、miR-151-5p、mi R-155、mi R-181a/181b、miR-184、miR-1、miR-501。肿瘤特异性增殖腺病毒介导的LncRNAi表达,可以竞争性消耗Oncomi Rs,广泛抑制OncomiRs相关的多条信号传导途径,发挥更有效的抗癌效应。这种方法克服了单一mi RNA干预肿瘤抑制效果有限、癌细胞通过旁路信号途径重新获得增殖活力的缺陷。以Survivin启动子调控腺病毒仅在Survivin阳性的肝癌细胞内特异性增殖,释放子代病毒杀伤更多的肿瘤细胞,而对正常细胞无影响。同时其介导表达的LncRNAi只对OncomiRs起作用,因而使其安全性和有效性得以改善。本研究以肝癌高表达的部分OncomiRs为靶点设计的抗癌策略,不仅可用于肝癌的治疗,同样可为其他肿瘤的治疗提供借鉴,为肿瘤治疗建立一种疗效可靠的技术平台。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7

【共引文献】