Th22细胞及相关因子在结直肠癌的表达及作用机理探讨

发布时间：2020-02-22 03:24

【摘要】：第一部分 Th22细胞及相关因子在结直肠肿瘤微环境的表达及临床意义目的Th22细胞是近年来发现的一种新型辅助性T细胞,在芳香族受体(AHR)的启动下主要分泌IL-22发挥功能作用,其早期研究主要集中在炎症性疾病与自身免疫性疾,在结直肠肿瘤微环境中的作用机制尚不清楚。本部分检测Th22细胞及相关因子在结直肠癌的表达分布情况,探讨其可能机制及临床意义。方法选取来自广西医科大学第一附属医院结直肠肛门外科2013年4月至2014年3月行结直肠癌切除手术的患者50例,所有患者均经病理证实为结直肠癌,并且能够经手术切除肿瘤。所有患者在手术前均没有接受放疗或化疗,术前无感染病史,既往无免疫性疾病病史,具有多个原发灶的患者也被排除。患者进行大肠癌手术切除时收集新鲜的肿瘤组织和癌旁组织(距离病灶5cm以上的正常大肠组织)进行实验。通过免疫组化方法验证Th22细胞的功能因子IL-22在结直肠癌肿瘤微环境中是否表达；使用流式细胞术检测结直肠癌组织及癌旁正常组织Th22细胞比例的变化,结合临床病理资料分析其临床意义；使用实时荧光定量PCR方法从基因水平证实检测结直肠癌肿瘤微环境中Th22细胞相关因子的表达情况,探讨Th22细胞分布差异的可能机制。结果免疫组织化学技术对10例结直肠癌患者的肿瘤组织及癌旁组织进行免疫组化染色结果显示结直肠癌患者的肿瘤组织及癌旁组织中均存在IL-22蛋白的表达,但肿瘤组织中表达更为明显。通过流式细胞术,以散射光FSC/SSC及CD4+T细胞亚群设门,分析Th22细胞的比例变化,结果显示Th22细胞在结直肠癌组织中的表达量明显高于癌旁的正常组织,差异有统计学意义,P0.05；受检的结直肠癌组织中,TNMⅢ-Ⅳ期的Th22细胞比例明显高于TNM Ⅰ-Ⅱ期,差异有统计学意义,P0.05；提示Th22细胞结直肠癌肿瘤微环境中聚集,并且随着肿瘤的进展含量增高。分析在结直肠癌肿瘤微环境中Th22细胞及Th17细胞的相关性显示,结直肠癌组织中Th22细胞的比例与Th17细胞的比例变化呈正相关,R=0.52,P0.05。对50例结直肠癌患者的肿瘤组织及癌旁正常组织的细胞因子进行了实时荧光定量PCR检测,以β-actin为内参基因计算相关因子的相对表达量。已知Th22细胞的关键转录因子为AHR,主要分泌IL-22；其表型特征为CCR4、CCR6和CCR10,对应的配体分别为CCL22、CCL20和CCL27。结果显示与癌旁正常组织相比,Th22细胞的功能因子IL-22和转录因子AHR结直肠癌组织中表达明显增高,P0.05,差异有统计学意义；该结果与免疫组化及流式细胞术的结果保持一致。趋化因子CCL20和CCL22在结直肠癌组织中表达明显比癌旁组织增高,P0.05,差异有统计学意义。此外,趋化因子CCL27在结直肠癌组织的相对表达量也较癌旁组织增高,但无统计学差异,P0.05。提示肿瘤微环境中含有大量Th22细胞相关的趋化因子。结论Th22淋巴细胞表达存在于结直肠癌组织及癌旁正常大肠组织中,Th22细胞在结直肠癌肿瘤微环境中高度表达,并且随着肿瘤的分期进展比例增高；通过肿瘤微环境的细胞因子分析表明,Th22细胞在结直肠癌中聚集,可能与肿瘤微环境所分泌的细胞因子对Th22细胞的趋化作用有关。第二部分IL-22在体外对大肠癌的作用研究目的通过IL-22在体外与结肠癌细胞株进行共培养,研究IL-22对大肠癌的作用,并使用STAT3抑制剂进行干预,对其可能作用机制进行探讨。方法购买人结肠癌RKO细胞株,进行复苏、常规培养、传代,取生长状态良好、对数期的细胞进行种板培养,使用细胞因子进行干预实验。将细胞培养12孔板分为空白对照组、IL-22干预组、IL-22联合STAT3抑制剂干预组三个小组,观察结肠癌细胞的增殖、凋亡情况。通过流式细胞术,使用凋亡试剂盒Annxin V PE和7-AAD观察细胞凋亡比例；使用细胞增殖相关的核抗原物质Ki-67抗体检测结肠癌细胞的增殖比例；统计分析各组的差异。结果通过IL-22与人结肠癌RKO细胞株在体外共培养或IL-22联合STAT3抑制剂(S31-201)与人结肠癌RKO细胞株在体外共培养或来判断IL-22在体外对结肠癌凋亡作用的影响及可能机制。通过流式细胞技术检测RKO结肠癌细胞的凋亡率我们可以发现,与空白对照组相比,IL-22可以明显抑制结肠癌细胞的凋亡,降低凋亡率,P0.05,差异有统计学意义；当IL-22联合STAT3抑制剂与结肠癌细胞进行共培养时,IL-22抑制结肠癌细胞凋亡的作用完全被逆转,P0.05,差异有统计学意义。表明Th22细胞的功能因子IL-22对大肠癌凋亡有抑制作用,其机制可能是通过STAT3信号通路来完成的。通过IL-22与人结肠癌RKO细胞株在体外共培养或IL-22联合STAT3抑制剂(S31-201)与人结肠癌RKO细胞株在体外共培养或来判断IL-22在体外对结肠癌增殖作用的影响及可能机制。通过流式细胞技术检测RKO结肠癌细胞的增殖比例我们可以发现,与空白对照组相比,IL-22可以明显促进结肠癌细胞的增殖,P0.05,差异有统计学意义；当IL-22联合STAT3抑制剂与结肠癌细胞进行共培养时,IL-22促进结肠癌细胞增殖的作用完全被逆转,P0.05,差异有统计学意义。表明Th22细胞的功能因子IL-22对大肠癌的增殖具有促进作用,其机制可能是通过STAT3信号通路来完成的。结论本部分研究通过IL-22与结肠癌细胞株体外共培养,阐明IL-22在结肠癌中起到促癌的作用,抑制了结肠肿瘤细胞的凋亡,促进增殖；其作用效应可以被STAT3抑制剂所逆转,提示IL-22可能是通过STAT3信号转导通路来发挥作用的。第三部分IL-22在小鼠大肠癌动物模型的作用研究目的目前针对Th22细胞的功能研究主要是通过其功能因子IL-22来进行,前面部分研究结果表明IL-22在体外对结肠癌细胞株具有保护作用,促进肿瘤细胞生长以及抑制凋亡。本部分研究通过BALB/c裸鼠动物建立结肠癌皮下移植瘤模型,使用IL-22及STAT3抑制剂进行干预,探讨IL-22在体内对大肠癌生长的作用及可能机制。方法常规培养结肠癌RKO细胞株,待细胞生长状态良好处于对数期时消化,以生理盐水调整细胞浓度,注射在BALB/c裸鼠皮下,建立结肠癌小鼠皮下移植瘤动物模型。待小鼠肿瘤体积达到60mmm3时随机分成3组(A组：空白对照组,B组：IL-22,C组：IL-22+STAT3抑制剂)隔天进行腹腔注射干预,隔天一次共5次,观察各组小鼠肿瘤生长情况,第11天颈椎脱臼法处死,完整切除肿瘤,游标卡尺测量计算终体积进行统计分析。称取一定量的小鼠肿瘤组织,进行匀浆,收集组织匀浆上清液,使用液相芯片技术检测各组小鼠肿瘤中IL-22蛋白的含量。结果本研究使用RKO结肠癌细胞进行小鼠皮下结肠癌模型的建立成功,饲养1周后所有的BALB/c裸鼠均成瘤,皮下可以触及；肿瘤体积达到60mm3时随机分成3组,腹腔注射药物进行干预。三组小鼠在给药过程中未出现明显的不良反应,空白对照组小鼠肿瘤缓慢平稳生长,而IL-22干预组小鼠肿瘤生长迅速,与对照组相比,第11天时肿瘤体积明显增大,638mm3±58mm3 vs.428mm3±51mm3,P0.05,差异有统计学意义；而IL-22联合S31-201进行给药时,IL-22对小鼠结肠癌生长的促进作用明显被逆转,第11天时肿瘤体积显著小于IL-22组,313mm3±38mm3 vs.638mm3±58mm3,P0.05,差异有统计学意义。表明IL-22可以在体内促进结肠癌的生长,其作用机制可能是通过STAT3信号通路来实施。为了进一步证实IL-22在体内对结肠癌生长的作用,我们对三组结肠癌小鼠皮下移植肿瘤进行组织匀浆,通过Luminex液相芯片系统检测小鼠肿瘤中IL-22蛋白的含量。结果表明,单独IL-22干预组小鼠肿瘤中IL-22蛋白的含量明显比空白对照组增高,124.1pg/ml±14.9pg/ml vs.25.36pg/ml±4.1pg/ml,P0.05,差异有统计学意义；然而,单独IL-22干预组与IL-22联合S3I-201干预组小鼠肿瘤中IL-22蛋白的含量相比无明显差别,124.1pg/ml±14.9pg/ml vs.118.3pg/ml±13.5pg/ml,P0.05,无统计学意义。表明IL-22确实在结肠癌肿瘤微环境中聚集并能够促进肿瘤生长,与第一部分人体标本的检测结果类似。结论本部分研究通过BALB/c裸鼠建立结肠癌皮下移植瘤动物模型,使用IL-22及STAT3抑制剂进行干预,在体内证实了IL-22对结肠癌生长的促进作用,其作用机制可能是通过STAT3信号通路来完成。本研究通过人体标本检测、体外细胞共培养以及动物模型一系列实验阐明Th22细胞及其功能因子IL.22在结直肠癌的表达及可能作用机制,为结直肠癌的免疫治疗提供了新的思路或靶点。
【图文】：

在发达国家是主要的致死病因，在发展中国家排行第呈增加趋势，很大部分原因是由于人口的增长老化和，例如吸烟、体力活动减少、肥胖和“西化”的饮食⑴。癌症研究机构权威发布的最新版本在线版数据库“全ＬＯＢＯＣＡＮ邋２０１２）显示，２０１２年全球新发癌症病例约１４０约８２０万，存活的癌症患者（被确诊５年以内）约３２００，全球男性的癌症发病率为２０５／１０万，女性的癌症发比女性氋出２５％。就地域分布来讲，男性发病率地区大利亚和新西兰（３６５／１０万），最低为西非（７９／１０万）；高为北美地区（２９５／１０万），最低为亚洲中南部（１０３／１地域差异则相对较小，男性为６９－１７３／１０万，女性为６５－１

利亚和新西兰（每１０万人口中男性为４４．８，女性为３２．２），发病率最低的逡逑地区为西非（每１０万人口中男性为４．５，女性为３．８）。结直肠癌的总体死逡逑亡率相对比较低，大约７５万，占８．５％，在欠发达地区则明显增高（图２）逡逑［２］。根据２０１２年《中国肿瘤登记年报》的数据，国内结直肠癌２０１０年新发逡逑例数２７．５万，发病率占所有癌症第３位；２０１０年死亡例数１３．２万，，死亡率逡逑占所有癌症第５位。逡逑Ｍ＊）＊逡逑ＷｆＳＳｗ邋Ｓｕ＞ｏ？＞ｒ逡逑ＩＶｉＷｆ逦ｉＷＢＢＩＨａＢｉＢＢＪｇｊｊｊｊｊｊｍｊＩＢｉＳＢＳｍｉ逡逑Ｗｅｒｅ邋ｄｋｗｉａｐｅｄ邋ｎｐｉｅｎｉ逡逑＜．？＜＃？邋Ｊｉｖｊ邋ｂｉＫａ＇Ｋ邋？Ｕ＇ｕｐｅ逡逑ｌＡＬＩＪｎｅｔＭ逦ｔａｕｉＭｌｌｌＬ邋售逡逑ｗ＊＞Ｍ逦＂＂＂＂ｗｉｉＢｉｒ＂＊逡逑ｉＢＪｉＳ＾ｆｖｒ＾ｃａ逡逑Ｓｃｕ＾￡？ａ？ｆ？－Ａｉ３逦—逡逑“＂ｔｆｍＡＭＭｄｎｗｉｗｎ逡逑Ｃｆｎｒ＊ｊ邋Ａｍｅｒｔｆ？逦＾ＳＢＳＴ逡逑Ｎｉ＞－－ｆｃｉｓｆｉ＇邋ＭＫ－ｔ逡逑＂Ｉ邋ｉｒ？逡逑ＳｔＲｆｌｈ－ＣｓｆＷ＊邋Ａｓｓｔ逡逑Ｍ－＾Ａｔｒｅ＊逡逑ｖｖｓａｓｍＷＭｉ逡逑＃５邋ｓｏ＂邋，ｒｙ邋，？；：邋ｌｌ邋Ｉ邋；？．？逦Ｔｌ邋２ｌ邋Ｗ逡逑？邋ｆｃ－－；：ｓａＲ＇ｃｅ逡逑图２．邋２０１２年全球结直肠癌分布（每１０万人口例数，引自ＧＬＯＢＯＣＡＮ２０１２官网）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ２．邋２０１２邋Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ邋Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ邋Ｃａｎｃｅｒ邋Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋（ｐｅｒ邋１００，０００，邋Ｃｉｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ＧＬＯＢＯＣＡＮ邋２０１２）逡逑１３逡逑
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34

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本文编号：2581800