家绳幼虫抗菌肽作用于肿瘤细胞sup-b15的初步研究

发布时间：2020-02-28 16:14

【摘要】：目的:利用家蝇幼虫抗菌肽针对急性淋巴细胞瘤sup-b15进行干预实验,并通过实验证明家蝇幼虫抗菌肽对肿瘤细胞sup-b15有抑制作用。研究内容由三部分组成:1.对比研究家蝇幼虫抗菌肽的分离纯化物与粗提物对sup-b15的抑制效能;2.验证家蝇幼虫抗菌肽联合伊马替尼对肿瘤细胞sup-b15是否具有增强抑制的作用;3.建立急淋白血病C57BL/6小鼠模型并探究家蝇幼虫抗菌肽对其是否具有延长生存期的作用。方法:通过针刺诱导、研磨、离心、C18柱固相萃取等方法制备家蝇三龄幼虫抗菌肽粗提物,利用反相高效液相色谱仪(RP-HPLC)进行分离纯化,应用CCK-8试剂盒检测细胞抑制率,采用流式细胞仪检测其诱导凋亡的效果。采用台盼兰拒染法,血球计数板计数并计算细胞存活率,利用倒置光学显微镜观察细胞并拍照。选取健康的C57BL/6小鼠,经环磷酰胺免疫抑制后,通过尾静脉接种肿瘤细胞sup-b15,以此建立急淋白血病小鼠模型。对其实施家蝇幼虫抗菌肽干预后,观察小鼠生存时间并绘制生长曲线,计算生命延长率。利用全自动血液检测仪对小鼠外周血细胞记数,并对结果进行统计学分析,然后进行骨髓推片检测并计算造模成功率。结果:实验一:利用反相高效液相色谱仪(RP-HPLC)分离纯化得到8种纯化物,按照蛋白含量增加(Increased)和新生成(Generate)分别标记为I1、I2、I3、I4组和G1,G2、G3、G4组。家蝇幼虫抗菌肽粗提物(Extracts)标记为E0组。通过CCK-8试剂盒检测发现,8种纯化物中有4种蛋白及粗提物(E0组)对sup-b15细胞有增殖抑制作用,细胞生存率均值分别为I1:71.4%、I2:78.5%、I4:64.1%、G2:68.6%、E0:56.1%。采用流式细胞仪检测其诱导细胞凋亡的效果,其凋亡率均值分别为I1:16.73%、I2:9.79%、I4:18.60%、G2:11.85%、E0:35.94%。实验二:光学显微镜下分别观察实验组与对照组的细胞生长状况,结果为:低倍镜与高倍镜下对照组的细胞增长旺盛,细胞密度大,细胞结构完整;实验组观察到的结果相对于对照组而言细胞出现不同程度的增殖缓慢,密度减小,形态相对不完整。其中联合用药组抑制效果最为明显,伊马替尼组的抑制效果较抗菌肽组明显。台盼兰染色后镜下血球计数板计数,细胞存活率分别为:对照组:(91.37±1.68)%;单一抗菌肽用药组:(54.71±2.76)%;单一伊马替尼用药组:(38.04±1.55)%;伊马替尼抗菌肽联合用药组:(21.19±1.27)%。实验三:实验初期(前4天)各组C57BL/6小鼠未出现明显异常反应。接种第5天后实验组小鼠生存质量较对照组小鼠出现不同程度的下降,第8天开始实验小鼠出现死亡。各实验组中造模成功的C57BL/6小鼠生存时间分别为:实抗组12.52±1.39天;实对组10.9±1.59天;实P组10.8±1.97天。计算得知实抗组生命延长率为13.15%。各实验组中造模成功的及对照组所有的C57BL/6小鼠外周血进行细胞检测,结果显示各实验组小鼠白细胞数量明显增高,红细胞及血小板数量明显减少,对照组小鼠各血细胞数量正常。骨髓推片镜下观察到小鼠的有核细胞增生异常活跃,原始淋巴细胞及幼稚淋巴细胞明显增多,占有核细胞的比例大幅度上升,成熟的淋巴细胞相对较少,其余各系统细胞较正常情况明显减少。实验组共有45只C57BL/6小鼠,其中造模成功的有13只,计算可得小鼠造模成功率为28.89%。结论:1.家蝇幼虫抗菌肽对肿瘤细胞sup-b15具有增殖抑制及诱导凋亡的作用,且家蝇幼虫抗菌肽粗提物对肿瘤细胞的抑制效果较纯化蛋白明显。2.家蝇幼虫抗菌肽可联合伊马替尼一同对肿瘤细胞sup-b15发挥抗癌作用,较单独用药时的抑制作用更强。而单一应用家蝇幼虫抗菌肽对肿瘤细胞sup-b15的抑制效果不及伊马替尼。3.家蝇幼虫抗菌肽在急性淋巴白血病的C57BL/6模型小鼠体内存在抑制肿瘤发生发展的作用。
【图文】：

抗菌肽,生存率,细胞的,统计学意义

山西医科大学硕士学位论文.2 CCK-8 试剂盒检测家蝇幼虫抗菌肽对 sup-b15 细胞生长抑制的结果CCK-8 结果显示，，与对照组相比，I1、I2、I4、G2、E0 组细胞生长得到明显，五组细胞的生存率（图 1-2）分别为（71.4±3.2）%、（78.5±2.3）%、（646.5）%、（68.6±3.4）%、（56.1±2.5）%,差异具有统计学意义（P<0.05），其与对照组相比，差异不具有统计学意义（P>0.05）。

抗菌肽,细胞凋亡,对照组,早期凋亡

6图 1-3 各组抗菌肽对 sup-b15 细胞的凋亡作用注：其中图 ABCDEF 分别代表对照组、I1、I2、I4、G2、E0 组表 1-1 各组抗菌肽作用 sup-b15 细胞凋亡结果组别早期凋亡（%）晚期凋亡与坏死（%）对照组 2.27±0.28 2.67±0.42I1 9.37±1.44 7.36±1.56I2 6.67±1.69 3.12±1.17I4 11.16±1.75 7.44±1.21G2 6.52±1.36 5.33±1.83E0 23.22±2.11 12.72±1.97
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-36

【参考文献】