Copine-3蛋白在肺腺癌细胞中的功能研究
发布时间：2020-03-20 19:50
【摘要】：Copine-3蛋白是由CPNE3基因编码的钙离子依赖性蛋白,是copines蛋白家族成员之一。该蛋白家族成员进化高度保守,功能多样,但是具体作用机理尚未明确。研究表明,copine-3蛋白与肿瘤等疾病的发生和发展具有相关性,其在生物体内,特别是肿瘤细胞中可能承担着重要的生物学功能。本研究首先通过western-blot和免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)发现copine-3蛋白在肺腺癌细胞系和肺腺癌患者癌组临床样品中都广泛表达,并且IHC表明copine-3蛋白主要分布在细胞质中,也有细胞核定位现象。将pEGFP-N1/CPNE3真核表达载体分别转染293T和H1299细胞,通过western-blot检测细胞亚组份和激光共聚焦观察表明copine-3蛋白定位于细胞质和细胞核中。然后,在肺腺癌A549细胞中,我们通过小干扰RNA(Small interfering RNA;siRNA)靶向干扰 CPNE3 基因表达后,Transwell实验表明细胞迁移能力显著增强(p0.01)。利用基于细胞培养条件下稳定同位素标记(stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)的差异蛋白质组学技术,鉴定了 51个在A549细胞中siRNA介导CPNE3基因沉默后表达发生变化的蛋白质。其中,SQSTMl/p62(由SQSTM1基因编码)是CPNE3基因沉默后显著下调的蛋白质,通过RNA干扰技术,在A549细胞中干扰SQSTM1基因促进了细胞的迁移,western-blot检测显示,上皮型钙黏附蛋白E-cadherin表达下调,波形蛋白Vimentin表达上调。这表明,CPNE3基因沉默后,通过下调SQSTM1/p62表达,促进上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的发生,从而促进细胞的迁移。同时,为进一步探讨copine-3的功能,我们利用慢病毒介导的shRNA在肺腺癌A549、H1299和SPC-A1细胞株中,稳定沉默了CPNE3基因的表达。平板克隆和软琼脂克隆形成实验表明,稳定沉默CPNE3基因能够促进肺腺癌细胞的增殖。此外,我们还成功构建了人支气管上皮细胞 HBE(human bronchial epithelial cells,HBE)细胞的CPNE3基因过表达细胞株,细胞实验结果表明CPNE3基因的过表达能够抑制HBE细胞的增殖。利用基于SILAC的差异蛋白质组学技术,我们鉴定了在A549中稳定沉默CPNE3基因后的差异表达蛋白质,共获得差异表达总蛋白质59个,差异核蛋白209个。最后,对通过SILAC技术获得的在A549细胞中siRNA干扰和稳定沉默CPNE3基因后的差异蛋白质组学数据进行了生物信息学分析。Gene Ontology分析和KEGG Pathway富集,显示这些差异蛋白参与多个生物学过程和通路。同时也完成了差异蛋白的相互作用网络的分析,为后续的信号转导通路实验研究提供了线索,为进一步探究copine-3蛋白的生物学功能,阐明copine-3蛋白调控肿瘤细胞迁移和增殖机制提供前期基础。
【图文】：
芯片置于苏木素染液中，轻度复染５邋ｍｉｎ，对细胞核进行染水冲洗１０邋ｍｉｎ返蓝。逡逑酒精分化ｌ0ｓ，自来水冲洗５邋ｍｉｎ。盐酸酒精：向７５％乙醇中与透明：将组织芯片置于７５％，８５％，９５％，邋１００％各级酒精中封片，显微镜观察。逡逑蛋白在各肺腺癌细胞中的表达逡逑胞系的遗传背景不同，细胞中一些蛋白的表达量也会有所差异。ＳＰＣ－Ａ１和Ｈ１２９９以及Ｈ３５８细胞，收集细胞抽提蛋白并定量，凝胶电泳，利用ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ检测了邋ｃｏｐｉｎｅ－３蛋白在人支气管上腺癌细胞系中的表达情况。逡逑
ｃｏｐｉｎｅ－３蛋白表达量略高于ＨＢＥ细胞中的表达量。逡逑２．３．２邋Ｃｏｐｉｎｅ－３蛋白在肺腺癌组织中的表达逡逑利用免疫组化检测了邋１５例肺腺癌组织临床样品，，结果如图２－２所示，ｃｏｐｉｎｅ－３蛋白逡逑在细胞质和细胞核中均有表达（棕色显色），且主要分布于细胞质中。逡逑：Ａ邋／邋Ｂ邋＾逡逑Ｉ＾Ｉ逡逑图２－２邋ｃｏｐｉｎｅ－３蛋白在肺腺癌组织中的表达逡逑Ｆｉｇ邋２－２邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｐｉｎｅ－３邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎ邋ｌｕｎｇ邋ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ邋ｔｉｓｓｕｅｓ逡逑Ａ：邋ｌｕｎｇ邋ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋（ｌ0ｘ）；邋Ｂ：邋ｌｕｎｇ邋ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋（４０ｘ）逡逑２．３．３肺腺癌细胞胞浆与胞核蛋白的分离逡逑为验证细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒对细胞两种组份的分离效果。首先利用逡逑肺腺癌细胞进行预实验。逡逑收集肺腺癌Ｈ１２９９和Ａ５４９细胞沉淀各２（ＨｉＬ，按２．２．８中方法对两种细胞的胞浆胞逡逑核蛋白进行抽提分离。如图２－３所示，加入抽提试剂Ｂ前，细胞结构完整；加入抽提试逡逑剂Ｂ后，在低n蛲秆固跫孪赴て屏眩隽粝孪赴恕ｅ义希保峰义
本文编号：2592106
【图文】：
芯片置于苏木素染液中，轻度复染５邋ｍｉｎ，对细胞核进行染水冲洗１０邋ｍｉｎ返蓝。逡逑酒精分化ｌ0ｓ，自来水冲洗５邋ｍｉｎ。盐酸酒精：向７５％乙醇中与透明：将组织芯片置于７５％，８５％，９５％，邋１００％各级酒精中封片，显微镜观察。逡逑蛋白在各肺腺癌细胞中的表达逡逑胞系的遗传背景不同，细胞中一些蛋白的表达量也会有所差异。ＳＰＣ－Ａ１和Ｈ１２９９以及Ｈ３５８细胞，收集细胞抽提蛋白并定量，凝胶电泳，利用ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ检测了邋ｃｏｐｉｎｅ－３蛋白在人支气管上腺癌细胞系中的表达情况。逡逑
ｃｏｐｉｎｅ－３蛋白表达量略高于ＨＢＥ细胞中的表达量。逡逑２．３．２邋Ｃｏｐｉｎｅ－３蛋白在肺腺癌组织中的表达逡逑利用免疫组化检测了邋１５例肺腺癌组织临床样品，，结果如图２－２所示，ｃｏｐｉｎｅ－３蛋白逡逑在细胞质和细胞核中均有表达（棕色显色），且主要分布于细胞质中。逡逑：Ａ邋／邋Ｂ邋＾逡逑Ｉ＾Ｉ逡逑图２－２邋ｃｏｐｉｎｅ－３蛋白在肺腺癌组织中的表达逡逑Ｆｉｇ邋２－２邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｐｉｎｅ－３邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎ邋ｌｕｎｇ邋ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ邋ｔｉｓｓｕｅｓ逡逑Ａ：邋ｌｕｎｇ邋ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋（ｌ0ｘ）；邋Ｂ：邋ｌｕｎｇ邋ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋（４０ｘ）逡逑２．３．３肺腺癌细胞胞浆与胞核蛋白的分离逡逑为验证细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒对细胞两种组份的分离效果。首先利用逡逑肺腺癌细胞进行预实验。逡逑收集肺腺癌Ｈ１２９９和Ａ５４９细胞沉淀各２（ＨｉＬ，按２．２．８中方法对两种细胞的胞浆胞逡逑核蛋白进行抽提分离。如图２－３所示，加入抽提试剂Ｂ前，细胞结构完整；加入抽提试逡逑剂Ｂ后，在低n蛲秆固跫孪赴て屏眩隽粝孪赴恕ｅ义希保峰义
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