YAP1对胰腺星形细胞活化和旁分泌的影响及作用机制

发布时间：2020-03-22 03:04

【摘要】：目的背景:胰腺导管腺癌(Pancreaticductaladenocarcinoma,PDAC)在人群中发病率和死亡率逐年升高。目前针对该肿瘤的治疗方法较为局限,药物治疗效果不佳,尚无突破性进展。显著的间质纤维化是PDAC特征性组织学表现,构成微环境物理屏障,阻碍药物到达肿瘤细胞。缓解PDAC间质纤维化能破坏该物理屏障,从而提升药物治疗有效率。PDAC中活化的胰腺星形细胞(Pancreatic stellate cells,PSCs)分泌大量细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM),参与间质纤维化的形成。另外,肿瘤与肿瘤微环境互相依存和促进,同时也互相限制和拮抗。肿瘤微环境可通过分泌、代谢、免疫等途径影响肿瘤的发生和发展。PSCs作为PDAC微环境中的主要成分,具有强大的分泌功能,对PCCs生长的影响不容忽视。Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)在肝脏星形细胞和乳腺成纤维细胞活化过程中有重要的调控作用,但对PSCs的作用尚不明确。本实验旨在研究YAP1对PSCs活化水平和旁分泌的调控作用及潜在作用机制。实验方法:原代PSCs由新鲜手术切除的PDAC组织经体外培养获得,利用全反式维甲酸(All-transretinoicacid,ATRA)处理PSCs使其去活化。通过油红O染色及α平滑肌肌动蛋白(Alpha smooth muscle actin,α-SMA)免疫荧光染色验证PSCs活化水平的改变。通过Western Blot和免疫荧光染色分别检测YAP1在对照组和ATRA处理组PSCs中的表达。利用YAP1小干扰RNA或YAP1抑制剂维替泊芬(Verteporfin,VP)抑制YAP1表达,并通过Western Blot和实时荧光定量PCR检测PSCs活化表型α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白的表达水平。利用YAP1小干扰RNA抑制YAP1表达,在倒置显微镜下观察PSCs的形态变化,分别利用CCK-8细胞增殖检测实验、流式细胞学技术、胶原收缩实验检测细胞增殖能力、细胞周期、细胞凋亡率及细胞收缩能力的改变。利用实时荧光定量PCR芯片筛选受YAP1调控的ECM基因,并通过实时荧光定量PCR、Western Blot和ELISA在三株PSCs中验证其表达和分泌。利用亚硫酸氢盐测序(Bisulfite sequencing,BSP)、生物信息学分析、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)、染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation,CHIP)和荧光素酶报告基因探索YAP1对此ECM基因的调控机制。利用PSCs条件培养基及transwell小室共培养系统研究PSCs旁分泌对PCCs增殖能力的影响。通过制作PDAC组织芯片(Tissuemicroarrays,TMA)、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色来评价YAP1和筛选出的细胞外因子在PDAC组织间质细胞中的表达水平,并分析其表达水平与临床病理特征之间关系。实验结果:PDAC组织培养5天后分离出PSCs,PSCs呈长梭形,有锋芒状突起,油红O染色呈阴性,α-SMA免疫荧光染色呈强阳性。PSCs经ATRA处理后形态变为矮胖三角形,油红O染色呈阳性,α-SMA免疫荧光染色呈弱阳性。Western Blot和免疫荧光染色结果均显示,与对照组相比,YAP1在ATRA处理组PSCs胞核中表达水平明显更低。抑制PSCs中YAP1的表达可下调α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达,改变梭形细胞形态,降低细胞的增殖能力,使细胞周期停滞在G2期,促进细胞凋亡,降低细胞收缩能力。PCR芯片结果分析显示,受YAP1调控最显著的ECM基因之一是富含半胱氨酸酸性分泌蛋白(Secreted protein acidic and cysteine rich,SPARC)(倍数变化为 13.3)。实时荧光定量 PCR、Western Blot和ELISA结果显示,敲低YAP1导致SPARC的mRNA表达、蛋白表达及分泌减少;过表达YAP1导致SPARC的mRNA表达、蛋白表达及分泌增多。BSP检测结果显示敲低YAP1对PSCs中SPARC启动子甲基化水平没有影响。生物信息学分析发现转录因子RUNX1可能介导YAP1对SPARC的调控作用。Co-IP实验证明YAP1蛋白和转录因子RUNX1之间存在相互作用。Western Blot结果显示敲低YAP1能上调RUNX1的表达。CHIP、荧光素酶报告实验及Western Blot证明RUNX1通过结合SPARC启动子来抑制SPARC的表达。取敲低YAP1的PSCs条件培养基孵育PCCs将促进其增殖,在此基础上过表达PSCs的SPARC将抑制这种促进作用。取过表达YAP1的PSCs条件培养基孵育PCCs将抑制其增殖,在此基础上敲低PSCs的SPARC将解除这种抑制作用。小室共培养的结果与之一致。基于IHC分析,YAP1和SPARC蛋白在PDAC组织间质细胞中的表达水平明显高于癌旁组织(P0.05)。PDAC间质细胞中YAP1与SPARC的表达水平呈正相关关系(r=0.433,P0.001)。PDAC间质细胞中YAP1的表达水平与间质纤维化程度呈正相关关系(r = 0.543,P0.001)。间质细胞中高表达水平的SPARC是PDAC总生存期的独立不良预后因素(HR = 3.216,P=0.005)。实验结论:YAP1在活化的PSCs中表达水平高,且抑制YAP1的表达能使PSCs去活化。在PSCs中,YAP1通过RUNX1的介导正性调控SPARC蛋白的表达及分泌。活化的PSCs通过旁分泌SPARC抑制PCCs的增殖。本研究为缓解PDAC间质纤维化提供新的治疗思路,并从旁分泌的角度分析了 PSCs-PCCs之间的关系,进一步阐释了肿瘤微环境的变化对肿瘤生长的影响。
【图文】：

形态图,原代培养,形态,胰体

图１：原代培养ＰＳＣｓ的镜下形态逡逑Ａ，用于原代培养的ＰＤＡＣ组织块及周围刚爬出的ＰＳＣｓ。Ｂ，培养２－３周后ＰＳＣｓ。（显微镜放大倍数：ｘ４0）逡逑表１：邋３例ＰＤＡＣ患者临床病理资料样本性别年龄（岁）分化程度大小（ｃｍ）邋位置邋ＴＮＭ分期逡逑＃１逦男逦６４逦高逦１．５逦胰头逦Ｔ１Ｎ２Ｍ１逡逑＃２逦女逦６８逦低逦２．５逦胰体、尾Ｔ２Ｎ１Ｍ０逡逑

处理组,和分布,对照组,情况

逦中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文逦逡逑３、ＹＡＰ邋１在不同活化水平ＰＳＣｓ中的表达情况逡逑为了比较ＹＡＰ１在不同活化水平ＰＳＣｓ中的表达情况，我们利用ＡＴＲＡ处理逡逑ＰＳＣｓ使其去活化，通过Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ及免疫荧光染色对ＹＡＰ１在三株ＰＳＣｓ中的逡逑表达及分布情况进行检测。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ结果发现在ＡＴＲＡ处理组细胞核蛋白中，逡逑ＹＡＰ１的表达水平较对照组低（图３Ａ）；在ＡＴＲＡ处理组细胞浆蛋白中，，ＹＡＰ１的逡逑表达水平较对照组高（图３Ａ）。免疫荧光染色结果也观察到ＹＡＰ１免疫荧光染色逡逑强度在ＡＴＲＡ处理组的ＰＳＣｓ胞核中比对照组更弱（图３Ｂ）。以上结果说明在逡逑ＡＴＲＡ诱导ＰＳＣｓ去活化后，ＹＡＰ１蛋白发生转位，在细胞核中表达减少。逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.9

【相似文献】