多发性骨髓瘤细胞源性外泌体参与T细胞免疫及长链非编码RNA H19参与硼替佐米耐药的机制研究

发布时间：2020-03-22 19:28

【摘要】：目的:研究多发性骨髓瘤(MM)细胞源性外泌体对正常人CD4~+T、CD8~+T及调节性T细胞数量及功能的影响,阐明骨髓瘤细胞外泌体对T细胞免疫的作用;研究多发性骨髓瘤患者血浆外泌体长链非编码RNA(lncRNA)H19表达水平与疾病疗效的相关性,阐明lncRNA H19在硼替佐米耐药发生中的作用并初步探索其机制。内容:分选健康供者和MM患者CD4~+T细胞、CD8~+T细胞和CD4~+CD25~+CD127~(dim)T细胞(调节性T细胞,Treg),与人骨髓瘤细胞系(OPM2,U266)外泌体共培养,检测T细胞凋亡、增殖,CD8~+T细胞穿孔素、颗粒酶B及Treg细胞IL-10和TGF-β的变化。检测健康供者血浆与MM患者血浆、外泌体和分选CD138~+细胞中lncRNA H19水平,通过耐硼替佐米骨髓瘤细胞系的培养,阐明lncRNA H19在骨髓瘤耐药发生中的作用。方法:第一部分MM细胞源性外泌体参与T细胞免疫的作用研究。采用超速离心法和外泌体提取试剂盒进行骨髓瘤细胞外泌体的提取,并应用透射电镜观察骨髓瘤细胞外泌体的形态。磁珠分选健康供者和MM患者CD4~+T细胞、CD8~+T细胞和CD4~+CD25~+CD127~(dim)T细胞,与骨髓瘤(OPM2,U266)源性外泌体进行共培养48h;采用流式细胞术检测上述T细胞的凋亡率,应用CCK8试剂盒检测T细胞增殖活性,流式细胞术检测骨髓瘤外泌体对CD8~+T细胞分泌穿孔素、颗粒酶B功能的影响,应用ELISA方法检测骨髓瘤外泌体对Treg细胞分泌IL-10和TGF-β功能的影响。第二部分lncRNA H19参与多发性骨髓瘤硼替佐米耐药的作用研究。采用实时定量PCR方法检测健康供者血浆和MM患者血浆、外泌体及CD138~+瘤细胞的lncRNA H19水平,并根据骨髓瘤患者病情进行分组,比较初治、缓解及难治复发患者与健康供者血浆中lncRNA H19的表达水平;体外培养MM细胞系(OPM2、U266和LP1),加入硼替佐米后,利用CCK8和Annexin V方法检测其增殖和凋亡,以观察其对硼替佐米药物的敏感性,并采用实时定量PCR方法检测MM细胞系lncRNA H19水平;通过逐渐增加硼替佐米药物浓度的方法,培养耐硼替佐米的MM细胞系,并比较lncRNA H19水平变化;采用慢病毒转染lncRNA H19,使其在MM细胞系(OPM2、U266)中过表达,检测过表达后MM细胞系硼替佐米敏感性的变化;采用Western blot方法检测敏感及耐药U266中NF-κB通路、AKT水平,实时定量PCR方法检测MDR1、TRX水平变化。结果:第一部分MM细胞源性外泌体参与T细胞免疫的作用研究采用外泌体试剂盒法和超速离心法成功分离得到骨髓瘤细胞来源的外泌体,并通过电镜观察,两者形态无明显差别。1、骨髓瘤细胞(OPM2、U266)外泌体与正常CD4~+T细胞共培养48h后,CD4~+T细胞凋亡率在OPM2组(6.24±1.24%)和U266组(5.42±1.07%)均明显高于对照组(4.37±0.96%)(P=0.0049,P=0.0007),而OPM2和U266外泌体共培养两组之间凋亡率无统计学意义(P0.05)。骨髓瘤细胞(OPM2、U266)外泌体与MM患者CD4~+T细胞共培养48h后,MM患者CD4~+T细胞凋亡率在OPM2组(14.56±4.65%)和U266组(16.42±5.08%)较对照组(13.83±5.69%)有增高趋势,但无统计学意义(P0.05)。2、健康供者CD4~+T细胞存活率在OPM2组(95.34±4.58%)和U266组(85.45±6.09%)较无外泌体组(100%)下降(P=0.331,P=0.0358),后者对CD4~+T的增殖抑制具有统计学意义。MM患者CD4~+T细胞存活率在OPM2组与U266组细胞增殖活性分别为98.61±2.80%和100.02±5.48%,与对照组相比,p值均0.05,无统计学意义。3、骨髓瘤细胞(OPM2、U266)外泌体与正常CD8~+T细胞共培养48h后,CD8~+T细胞凋亡率在OPM2组(9.97±1.28%)和U266组(11.00±1.75%)均较对照组(16.12±2.95%)明显降低(P=0.021,P=0.018),而OPM2和U266两组之间凋亡率无统计学意义(P0.05);骨髓瘤细胞(OPM2、U266)外泌体与MM患者CD8~+T细胞共培养48h后,MM患者CD8~+T细胞凋亡率在OPM2组(14.40±4.86%)和U266组(14.39±4.36%)低于与对照组(17.37±4.05%),但CD8~+T细胞凋亡率的下降无统计学意义(P0.05)。4、健康供者CD8~+T细胞存活率在OPM2组(112.63±3.88%,P=0.0099)和U266组(111.70±3.62%,P=0.0322)较对照组明显升高,具有统计学意义,提示骨髓瘤外泌体可促进健康供者CD8~+T的增殖。MM患者CD8~+T细胞存活率在OPM2组(101.58±10.82%)和U266组(100.31±10.80%)较对照组变化不明显,无统计学意义(P0.05)。5、健康供者CD8~+T细胞穿孔素水平在OPM2外泌体组(10.82±2.53%)和U266外泌体组(9.34±2.36%,P=0.044)均低于对照组(12.76±3.31%),且U266组具有统计学意义;OPM2和U266两组之间CD8~+T细胞穿孔素水平变化无统计学意义(P0.05)。MM患者CD8~+T细胞穿孔素水平在OPM2外泌体(6.48±1.06%)和U266外泌体组(5.63±1.15%)较对照组(10.55±2.50%)均明显减低(P=0.049,P=0.027),OPM2和U266两组之间穿孔素水平无统计学意义。6、健康供者CD8~+T细胞颗粒酶B水平在OPM2组(31.87±6.10%)和U266组(32.99±7.08%)均较对照组(28.74±6.21%)稍有增高,但无统计学意义(P0.05)。MM患者CD8~+T细胞颗粒酶B水平在OPM2组(34.48%±9.98%)和U266组(41.49±9.17%)与对照组(34.91±8.14%)变化不明显,无统计学意义(P0.05)。7、骨髓瘤细胞(OPM2、U266)外泌体与正常Treg细胞共培养48h后,Treg细胞凋亡率在OPM2组(15.33±3.87%)和U266组(11.71±2.71%)均较对照组(19.61±3.50%)明显降低(P=0.041,P=0.008),而OPM2和U266外泌体共培养两组之间凋亡率无统计学意义(P0.05);骨髓瘤细胞(OPM2、U266)外泌体与MM患者Treg细胞共培养48h后,MM患者Treg细胞凋亡率在OPM2组(30.91±7.25%)和U266组(37.29±6.54%,P=0.023)高于与对照组(29.95±6.68%),且U266组Treg细胞凋亡率升高有统计学意义。8、骨髓瘤外泌体与健康供者Treg细胞共培养48h,健康供者Treg细胞存活率在OPM2组(139.54±23.24%)和U266组(173.48±34.99%,P=0.043)均较无外泌体组升高,且U266组升高具有统计学意义,提示骨髓瘤外泌体可促进健康供者Treg的增殖。MM患者Treg与外泌体(OPM2或U266)共培养48h后,Treg存活率在OPM2组和U266组分别为82.29±12.16%和85.09±13.50%,其中与OPM2组Treg细胞增殖活性降低,具有统计学意义(P=0.031)。9、健康供者Treg细胞IL-10水平在OPM2组(18.53±8.08pg/ml,P=0.043)和U266组(13.51±7.83pg/ml)较对照组(8.49±4.02pg/ml)升高,OPM2组具有统计学意义,而OPM2和U266两组之间IL-10水平无统计学意义(p0.05)。MM患者Treg细胞上清IL-10水平在OPM2组(3.29±1.84pg/ml)和U266组(2.60±1.72pg/ml)与对照组(1.39±1.02pg/ml)相比,有升高趋势,但差异无统计学意义(P0.05)。10、健康供者Treg细胞TGF-β水平在OPM2组(417.57±19.33pg/ml)和U266组(325.96±14.32pg/ml)较对照组(386.60±28.89pg/ml)无明显变化(P0.05)。MM患者Treg细胞上清TGF-β水平在OPM2组(290.29±23.21pg/ml,P=0.0046)和U266组(230.03±15.96pg/ml,P=0.0068)较对照组(387.49±21.60pg/ml)均明显降低,具有统计学意义。11、健康供者CD4~+和CD8~+T细胞与OPM2外泌体共培养后,lncRNA H19表达水平在共培养组(2~(1.52±1.99))较对照组(2~(0.00±2.2))升高,具有统计学意义(P=0.012)。第二部分lncRNA H19参与多发性骨髓瘤硼替佐米耐药的作用研究1、血浆中lncRNA H19表达水平以中位数(四分位距)表示,在MM患者初诊组、缓解组、难治复发组和健康对照组分别为4.1740(10.07)、3.3784(6.22)、12.8723(38.1)、1.0867(1.48),四组之间差异有统计学意义(P0.01)。其中难治复发组显著高于初诊组(P=0.005)、缓解组(P0.001)和健康对照组(P0.001),初诊组高于健康对照组(P=0.048),初诊组与缓解组比较差异无统计学意义(P=0.174)。2、检测MM患者血浆外泌体中lncRNA H19表达水平,MM初诊组、缓解组和难治复发组患者的相对表达量分别为0.7071(1.42)、2.8481(6.80)、9.5137(23.38)。三组之间差异有统计学意义(P=0.004),采用方差分析进行组间两两比较,lncRNA H19表达水平难治复发组显著高于初诊组(P=0.015)、缓解组(P=0.014),初诊组与缓解组比较差异无统计学意义(P=0.692)。3、MM患者骨髓CD138~+瘤细胞中lncRNA H19表达水平与自身血浆中lncRNA H19水平呈正相关(Pearson相关系数r=0.745,P0.001;Spearman相关系数r=0.639,P=0.002)。4、骨髓瘤OPM2、LP1和U266敏感株硼替佐米的IC50值分别为22.85nM,7.22nM和4.25nM,其相应lncRNA H19的相对表达量分别为2~(0.31±1.85)、2~(-6.74±0.49)、2~(-9.12±2.00),提示硼替佐米的敏感性可能与lncRNA H19相关。5、通过硼替佐米耐药细胞系的培养,三种耐药细胞系在硼替佐米加药后存活率较敏感细胞明显升高,凋亡率(U266、LP1)明显降低。耐药OPM2、U266和LP1硼替佐米的IC50值分别为82.91nM,370nM和84.65nM,与各自敏感细胞IC50值对比,耐药倍数分别为3.63倍,87.06倍和11.72倍,其中U266耐药倍数最高。6、耐药OPM2、U266和LP1细胞lncRNA H19水平分别为2~(3.8795±0.5064)、2~(1.7595±0.3154)、2~(2.6429±0.8559),均较相应敏感细胞系升高,其中U266和LP1细胞系在耐药株有明显升高,P值分别为0.037和0.010。提示lncRNA H19与MM细胞系硼替佐米耐药的发生有关。7、通过慢病毒转染,在OPM2和U266细胞系中过表达lncRNA H19,过表达倍数分别为1858倍和3,070,410倍。采用CCK8方法检测过表达lncRNA H19的OPM2细胞系存活率,体外加入硼替佐米药物浓度分别为10nM、20nM、40nM、80nM和160nM。48h后,过表达lncRNA H19的OPM2细胞系的存活率(%)分别为100.50±14.85,83.04±11.24,77.51±15.75,73.00±3.47,70.88±10.71;空白转染OPM2细胞系存活率(%)分别为88.00±8.20,80.22±6.08,72.89±8.50,59.74±13.89,51.83±8.71,OPM2对照组存活率(%)分别为83.01±2.84,54.66±7.61,18.41±3.79,11.69±2.16,7.87±0.93。其中OPM2过表达lncRNA H19后,OPM2-H19转染组在硼替佐米20nM、40nM、80nM和160nM浓度下,存活率均高于对照组,P值分别为0.007、0.040、0.001、0.001,有明显统计学意义,提示OPM2-H19转染细胞对硼替佐米药物的敏感性降低。8、WB显示AKT、pAKT和NF-κB在U266敏感细胞系硼替佐米给药组较不给药组,均明显受到抑制;而U266耐药株在加药组较不加药组,AKT、pAKT抑制不明显;U266耐药株的NF-κB几乎不能表达,提示与硼替佐米敏感株不同,NF-κB在硼替佐米耐药机制中可能并不发挥主要作用。9、qPCR检测发现,MM细胞系MDR1水平与lncRNA H19水平呈正相关关系,具有统计学意义(r=0.546,P=0.035);MM细胞系TRX水平与lncRNA H19水平可能存在相关性(r=0.513,P=0.051)。结论:1、骨髓瘤细胞外泌体可以促进正常CD4~+T细胞凋亡、抑制增殖,抑制正常CD8~+T凋亡、促进增殖,但抑制穿孔素分泌。骨髓瘤细胞外泌体抑制正常Treg凋亡、促进增殖,并促进IL-10分泌。提示骨髓瘤外泌体可作为抗原刺激,促进CD8~+T细胞和Treg细胞增殖,但抑制正常T细胞的免疫功能。骨髓瘤细胞外泌体可导致T细胞lncRNA H19表达增高,提示T细胞的免疫功能改变可能与lncRNA H19相关。2.多发性骨髓瘤患者的血浆lncRNA H19水平较健康供者显著升高,并且在多发性骨髓瘤复发难治组患者较初治组和缓解组均明显升高,表明lncRNA H19与多发性骨髓瘤的发生及进展密切相关。多发性骨髓瘤患者血浆lncRNA H19水平与血浆外泌体中及骨髓CD138~+浆细胞中lncRNA H19水平呈正相关,提示血浆中的lncRNA H19来源于骨髓中的恶性浆细胞,并且可以通过外泌体释放进入血浆中。3.多发性骨髓瘤细胞系(OPM2、U266、LP1)lncRNA H19水平与硼替佐米药物敏感性相关,lncRNA H19高表达的细胞,硼替佐米的IC50值更高,提示lncRNA H19与硼替佐米耐药有关。通过增加硼替佐米药物浓度培养,建立耐药细胞系(U266),发现耐药细胞系较敏感细胞系lncRNA H19显著升高,在药物作用下,耐药细胞较敏感细胞凋亡率明显降低、细胞增殖活性明显升高。提示lncRNA H19与多发性骨髓瘤耐药相关,耐药机制可能与MDR1、NF-κB及PI3K/Akt通路相关。
【图文】：

机制,骨髓瘤,细胞

6图 2 lncRNAH19 的作用机制（摘自 Regulation of Human Breast Cancer bthe Long Non-Coding RNA H19, Int J Mol Sci. 2017 Nov 3;18(11)）研究目的、方法第一部分：研究主要探讨多发性骨髓瘤源性外泌体对 T 细胞（CD4+T 细CD8+T 细胞和 Treg 细胞）免疫的作用，，从 T 细胞凋亡、增殖及功能的变化步探索骨髓瘤外泌体对 T 细胞免疫的影响，进一步阐明外泌体在骨髓瘤发展中的机制，为骨髓瘤的治疗提供理论依据。本部分实验共分两部分：一、骨髓瘤外泌体的提取及鉴定：采用超速离心法和外泌体提取试剂盒进髓瘤细胞外泌体的提取，并应用透射电镜观察外泌体的形态。二、骨髓瘤外泌体对 T 细胞功能的影响：磁珠分选 CD4+T 细胞、CD8+T 细

超速离心法,骨髓瘤细胞,透射电镜观察,博士学位论文

透射电镜观察骨髓瘤细胞系外泌体（超速离心法）
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733.3

【参考文献】