PKM2苏木化修饰促进肺腺癌细胞糖酵解及增殖

发布时间：2020-03-26 05:11

【摘要】：研究背景和目的即使在氧气供应充足的情况下,肿瘤细胞仍优先选择糖酵解来提供能量,这一肿瘤细胞代谢特征被称为“瓦尔伯格(Warburg)效应”。糖酵解过程只产生少量的ATP,但可以积累大量的代谢中间产物从而为细胞增殖提供必需的原材料(如核苷酸,氨基酸,脂类)。丙酮酸激酶是糖酵解过程中重要的限速酶之一,催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和二磷酸腺苷(ADP)转变成丙酮酸和三磷酸腺苷(ATP)。真核细胞中存在四种丙酮酸激酶剪切异构体,分别是L型丙酮酸激酶(PKL)、R型丙酮酸激酶(PKR)、M1型丙酮酸激酶(PKM1)和M2型丙酮酸激酶(PKM2),分别在人体不同的组织细胞中特异性表达。PKL在肝细胞中表达,PKR在红细胞中表达。PKM1和PKM2来源于同一前体mRNA,但是经历了不同的剪切过程。PKM1主要表达于人体正常组织,而PKM2仅在肿瘤组织和胚胎组织中表达。作为糖酵解过程的一个关键限速酶,PKM2对肿瘤细胞瓦尔伯格效应的调控发挥非常重要的作用,然而调控PKM2的分子机制鲜有报道。翻译后修饰是一种重要的蛋白质功能调控机制,已有关于PKM2磷酸化、乙酰化、甲基化等修饰的报道。SUMO1(小泛素相关修饰蛋白1)修饰是一种重要的翻译后修饰类型,已有文献报道SUMO1具有增强肿瘤细胞糖代谢的功能,然而,SUMO1参与调控肿瘤糖代谢的具体机制仍不清楚。本课题通过一系列实验,证实SUMO1通过修饰PKM2进而影响肿瘤细胞糖酵解过程及细胞增殖。方法回顾性分析73例肺腺癌患者的临床病理资料,取癌组织标本行PKM2的免疫组化检查。分析肺腺癌患者PKM2表达与临床病理特征的关系,进一步使用Kaplan Meier曲线分析肺腺癌患者PKM2表达与预后的关系。通过体内及体外苏木化实验,证实SUMO1是否可以修饰PKM2;通过SUMO修饰软件预测可能的PKM2 SUMO1修饰位点,并通过体内及体外苏木化实验进行验证。通过~(18)F-FDG摄取,乳酸检测,观察SUMO1对肿瘤细胞糖代谢的影响;通过依赖性实验观察SUMO1对糖代谢的影响是否依赖于PKM2。在A549细胞中过表达或敲除内源性SUMO1基因,通过实时荧光定量PCR与蛋白质免疫印迹技术观察PKM2 mRNA和蛋白水平的变化。通过~(18)F-FDG摄取,乳酸检测,海马技术观察PKM2 SUMO1修饰对肿瘤细胞糖代谢及线粒体功能的影响;通过免疫沉淀技术获得真核细胞来源的重组蛋白纯化产物,然后检测丙酮酸激酶活性;通过荧光素酶报道基因检测及实时荧光定量PCR技术观察SUMO1修饰是否影响PKM2对HIF-1α转录共激活作用;通过细胞计数,克隆形成实验及裸鼠皮下异种移植瘤实验观察PKM2 SUMO1修饰对肺腺癌细胞A549增殖及裸鼠皮下成瘤能力的影响。结果PKM2的表达水平与肺腺癌的分化程度、淋巴结转移、TNM分期相关(p0.05)。与PKM2低表达肺腺癌患者相比,PKM2高表达肺腺癌患者的总体生存率(P=0.017)及术后无复发生存率均较低(P=0.027)。体内体外苏木化实验证实,PKM2可以被SUMO1修饰,第336位赖氨酸是其主要的修饰位点。使用小干扰技术在A549细胞中敲除SUMO1基因后PKM2蛋白量明显减少,而PKM2 mRNA水平没有变化;在细胞中过表达外源性SUMO1后,发现PKM2蛋白表达水平增加;进一步实验发现,SUMO1通过抑制PKM2溶酶体途径降解而影响其蛋白稳定性。通过检测细胞~(18)F-FDG摄取与乳酸产生,我们发现SUMO1修饰可以促进肿瘤细胞糖代谢,并且是依赖于PKM2的。SUMO1修饰可以抑制PKM2丙酮酸激酶活性,促进肿瘤细胞~(18)F-FDG摄取与乳酸产生。通过荧光素酶报道基因检测与实时荧光定量PCR技术,我们发现,SUMO1修饰可以促进PKM2对HIF-1α转录共激活作用。通过细胞计数,克隆形成实验及裸鼠皮下异种移植瘤实验,我们证实,无论在体内还是体外,SUMO1对PKM2蛋白修饰均可促进A549细胞的增殖。结论综上所述,本研究通过揭示PKM2 SUMO1修饰促进肺腺癌细胞糖酵解的分子机制,从而为日后肿瘤靶向治疗提供了重要的理论依据。
【图文】：

免疫组化染色,肺腺癌,染色率,临床病理特征

3C 3D图3. PKM2免疫组化染色结果Figure 3. Immunohjistochemical staining for PKM2性染色率/阳性染色程度=（0/0）; 图3B.阳性染色率/阳性染色程度=（1/1）；性染色率/阳性染色程度=（2/2）; 图3D.阳性染色率/阳性染色程度=（3/3）。 PKM2与肺腺癌患者临床病理特征之间的关系过免疫组化染色结果分析 PKM2 的表达与 73 例肺腺癌患者临床病理关系，结果显示 PKM2 的表达水平与肺腺癌的分化程度、淋巴结转分期相关（p<0.05），与患者的年龄、性别无关（p>0.05）（表 5）。表5. PKM2的表达与肺腺癌患者临床病理特征的相关性(n=73) 5. Relationship between PKM2 expression and Clinical-Pathologic CharacteristicsPKM2 expression P-vables Negative(n=43) Positive(n=30)

纯化技术,结合酶,活化酶,免疫沉淀

图5. PKM2在体内可以被SUMO1修饰Figure 5. PKM2 could be modified by SUMO1 in vivoT 细胞中共转染 HA-PKM2 或 HA 空载，与 Flag-SUMO1。在完全 DME使用 NEM-PBS(20 mM NEM in PBS)清洗细胞并收集。使用 NEM-，HA 琼脂糖珠对细胞裂解液行免疫沉淀，，样品以抗 HA 与抗 t 分析。我们发现，在体内 PKM2 可以被 SUMO1 修饰，为了支持我们使用体外 SUMO 修饰试剂盒来检测 PKM2 在体外是否饰。首先我们通过大肠杆菌 DE3 表达，HIS 纯化技术获得白。与范素化修饰类似，SUMO 修饰也是由一系列酶促反应修饰的第一步是 SUMO 活化酶 E1 激活 SUMO1 羧基端并移至 SUMO 结合酶 E2，而这个过程依赖于 ATP 的。我们根制体外 SUMO 修饰体系，按要求加入所有成分后，一组加入
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2

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