单细胞RNA-Seq研究调节性T细胞在肿瘤浸润淋巴细胞中的分化

发布时间：2020-03-26 20:22

【摘要】：调节性T细胞(Regulatory Tcells,Tregs)自从被发现以来,已经成为人们的研究热点。Tregs在自身免疫疾病和炎症中发挥重要的作用。同时,Tregs在肿瘤生长和转移中也扮演了重要的角色。近几年,针对Tregs的免疫检查点抑制剂在非小细胞肺癌,黑色素瘤和结直肠癌等癌症的治疗中起到积极作用。研究Tregs分化早期表达谱的变化可以帮助我们更好的理解Tregs。使用RNA测序(RNA-Seq)进行表达谱分析是一种研究生物学动态过程变化的强大的技术。本次研究,我们利用RNA-Seq技术探索Tregs分化过程表达谱的变化情况。通过差异分析分析,我们找到了 Tregs在5h,12h和48h的差异显著基因,同时也找到了这些基因参与的生物学过程,比如Jak-STAT信号通路,TNF信号通路和PI3K-Akt等信号通路。在癌症早期,免疫细胞有杀死癌细胞的作用。但是在癌症晚期,由于大量存在的免疫抑制细胞,如肿瘤相关巨噬细胞,Tregs和髓源移植性细胞等,抑制了肿瘤杀伤性T细胞的活性。进而促进肿瘤免疫逃逸,生长和转移。了解肿瘤微环境中免疫细胞的亚型,以及肿瘤细胞通过何种机制调节周围的免疫细胞表达,对我们治疗癌症有重要的意义。最近几年,单细胞RNA测序技术(scRNA-seq)迅猛发展,并即将取代大批量RNA-Seq(bulk RNA-seq)。通过分析单细胞水平上的转录组,scRNA-seq为复杂的生物系统提供了新的见解,并赋予生物体内每个细胞一个独特的身份。这使得我们能够解决在过去几年中一直被回避的科学问题,比如肿瘤的异质性。于是我们先建立了 scRNA-seq数据分析流程,用其分析黑色素瘤单细数据,最终得到了和原文相似的结果。同时我们又建立了混合线性模型,找到了肿瘤细胞调控Tregs,B细胞以及CD8+T细胞表达的基因,并探讨了这些基因参与的生物学过程。其中和Tregs显著关联的基因主要参与一氧化氮代谢过程,和B细胞显著关联的基因主要参与INF-I信号通路,和CD8+ T细胞显著关联的基因主要参与调节对刺激反应的生物过程。
【图文】：

富集分析是采用超几何分布的方式，将基因富集在己有的通路中，探讨这些逡逑基因的功能。目前已经有许多工具可以做富集分析，比如Ｇｅｎｅ邋Ｓｅｔ邋Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ逡逑Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）［ｌｕ］，ＤＡＶＩＤ［ｍ＿邋ｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒ〖１１３］等等。ＧＳＥＡ邋只针对人的基因，逡逑不能选择其它物种做。ＤＡＶＩＤ虽然可以选择多个物种，但是它和ＧＳＥＡ邋—样，逡逑更新的速度过慢，就导致了很多新发现的通路不能被富集出。本次实验使用逡逑ｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒ做富集分析，它既可以选择多物种注释，同时包的更新速度很快，逡逑具有注释最新的优点。做ＧＯ分析的时候，只关注生物学过程（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｐｒｏｃｅｓｓ），逡逑使用０．０５的ｑｖａｌｕｅ值作为显著性水平。对于ＫＥＧＧ分析，使用０．１的ｑｖａｌｕｅ值逡逑作为显著性水平。逡逑

对到基因组；５）用ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ软件将ｒｅａｄｓ比对到基因上；６）使用ＵＭＩ－ｔｏｄｓ逡逑生成每个细胞的每个基因的表达矩阵，并将引物信息和ｐｌａｔｅ邋ｂａｒｃｏｄｅ信息加入逡逑表达矩阵的列名中。ＭＡＲＳ－Ｓｅｑ数据分析的流程如图２。逡逑＾３Ｓｉｉ３Ｓ３逡逑？邋Ｒｅｍｏｖｅ逦？邋Ｆｉｎｄ邋ｃｅｌｌ逦？邋Ｓｐｌｉｔ邋ｆａｓｔｑ逦？邋Ａｌｉｇｎ邋ｒｅａｄｓ逦？邋Ｃｏｕｎｔ逡逑ｆｉｒｓｔ邋３ｂｐ逦ｂａｒｃｏｄｅ逦ｆｉｌｅｓ逦ｔｏ邋ｇｅｎｏｍｅ逦ｕｎｉｑｕｅ邋ｒｅａｄｓ逡逑？邋Ｅｘｔｒａｃｔ邋ＣＢ逦ｐｅｒ邋ｇｅｎｅｓ逡逑ａｎｄ邋ＵＭＩ逦！逦ｐｅｒ邋ｃｅｌｌ逡逑ｌ邋ｊ邋１逦＿Ｊ逦１邋ｊ邋１逦１逦［逦？逡逑图２邋ＭＡＲＳ－Ｓｅｑ测序数据预处理逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ邋ｏｆ邋ＭＡＲＳ－Ｓｅｑ邋ｆａｓｔｑ邋ｆｉｌｅｓ逡逑２．３．２得到表达矩阵之后的处理逡逑２．３．２．１邋质控逡逑得到表达矩阵之后，首先要对数据做质控，即评估数据质量同时去除技术误逡逑差。可以从以下三个方面考虑：１）统计每个细胞表达基因数目，，将表达量比较逡逑低的细胞去除；２）去除表达量比较极端的样本：３）筛选有高度生物学变异的基逡逑因，具体的方法如前言所述。逡逑２．３．２．２数据标准化逡逑在数据标准化之前
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.3

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本文编号：2601919