EZH2和H3K27me3在人结肠癌组织中的表达模式及EZH2调节结肠癌细胞侵袭、转移的研究

发布时间：2020-03-28 20:20

【摘要】：目的:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,它的发病率和死亡率在男性和女性患者中均位列第三位。尽管随着手术技术的提高和放化疗方案的完善,结直肠癌患者的预后得到了较大改善,但仍有近50%的患者出现局部复发和远位转移。因此,找到一种敏感的分子标志物来预测结直肠癌患者的预后是当今的研究热点。Zeste基因增强子同源物2(Enhancer of zeste homologue 2,EZH2)是多梳蛋白家族(PcG)中的一员,通过组蛋白甲基转移酶中高度保守的SET区域可催化组蛋白H3第27位(H3K27m3)赖氨酸进行甲基化修饰,从而抑制多种抑癌基因的表达,发挥其调控作用。本研究拟采用免疫组化方法检测EZH2和H3K27m3在55例结直肠癌组织及其配对的正常组织中的表达情况,并结合结直肠癌的临床病理特征分析EZH2和H3K27m3在结直肠癌中的表达模式及两者的表达相关性,并分析EZH2和H3K27m3对结直肠癌患者预后的预测作用。随后,通过体外构建敲低EZH2的结肠癌细胞株进一步验证EZH2对结肠癌细胞侵袭能力的调控作用。方法:1.收集2012年1月至2012年12月沧州市中心医院肿瘤外科收治的55例结直肠癌患者的成对癌及癌旁组织。利用免疫组化方法检测EZH2及H3K27m3蛋白在癌组织及癌旁组织中的表达情况,比较两者在癌组织及癌旁组织的表达水平,并测定二者表达的相关性。2.收集55例患者的临床病理信息,结合EZH2及H3K27m3在癌组织中的表达情况分析两者表达模式与结直肠癌临床病理特点的关系。3.结合EZH2、H3K27m3在癌组织中的表达情况及结直肠癌患者的随访结果,分析两者与患者总生存率及无病生存期的关系及对预后的预测作用。4.应用实时定量荧光PCR及Western Blot方法检测RKO、HCT-116、LoVo及DLD-1四种结肠癌细胞系中EZH2的表达情况,并选择表达较高的细胞系转染siRNA构建敲低EZH2表达的细胞系,并应用实时荧光PCR及Western Blot方法验证敲低效果。5.应用对照组细胞系及敲低EZH2的结肠癌细胞系进行Transwell细胞侵袭实验,探索EZH2对结肠癌细胞侵袭能力的调控作用。6.所得数据应用SPSS 22.0统计软件处理。免疫组化结果采用卡方检验及Spearman相关性检验进行分析;Kaplan-Meier法用于绘制患者的生存曲线,单因素及多因素生存分析应用COX回归模型进行。所有数据用mean±SD表示,两独立样本的比较应用成组t检验来进行分析,多组间均数比较应用单因素方差来进行分析,多样本均数间多重比较应用Tukey检验。每组实验至少独立重复3次,以P0.05为差异有统计学意义,置信区间在95%置信水平表示。结果:1.在本研究中的55例结直肠癌标本中,EZH2的高表达率为58.2%,H3K27me3的高表达率为45.5%。配对正常组织中,EZH2的高表达率仅为14.5%,H3K27me3的高表达率仅为18.2%。将EZH2和H3K27me3的IRS评分做统计学分析发现,两者在癌组织与配对正常组织表达水平有显著统计学差异(P0.001)(图1)。2.EZH2和H3K27me3蛋白的表达水平呈现明显的正相关(r~2=0.2396,P=0.0001)。3.利用χ~2检验分析EZH2和H3K27me3与临床病理特征之间的关系发现EZH2和H3K27me3的高表达与更多的淋巴结转移(EZH2,P=0.008;H3K27me3,P=0.021)以及远处转移(EZH2,P=0.003;H3K27me3,P=0.002)显著相关;并且,EZH2的高表达患者更容易发生脉管侵犯(P=0.009)。4.单因素预后分析显示EZH2和H3K27me3高表达预示着更短的OS EZH2:HR 4.56,95%CI 1.31-15.78,P=0.008,H3K27me3:HR 3.86,95%CI1.46-10.19,P=0.003)和DFS(EZH2:3.89,95%CI 1.24-12.17,P=0.019;H3K27me3:2.85,HR 95%CI 1.69-6.98,P=0.011)。5.进一步多因素分析发现,经过临床病理因素矫正后,H3K27me3和EZH2并不是OS(EZH2:HR 1.77,95%CI 0.48-6.40,P=0.384;H3K27me3:HR 95%CI 2.04 0.44-9.51,P=0.361)和DFS(EZH2:HR 1.03,95%CI0.34-3.12,P=0.947;H3K27me3:HR 3.19,95%CI 0.79-12.76,P=0.101)的独立预后因素;而TNM临床分期是唯一的独立预后因子(OS:P=0.024,DFS:P=0.012)。6.qPCR及Western blot法测定RKO、HCT-116、LoVo、DLD-1四种结肠癌细胞中EZH2 mRNA及EZH2蛋白相对表达量,EZH2在RKO及LoVo细胞中表达最高,结果具有统计学意义(P0.05)。7.通过转染siRNA成功建立敲低EZH2的RKO及LoVo细胞模型,qPCR及Western blot法验证敲低效果,EZH2在RKO-si EZH2-1、RKO-siEZH2-2及LoVo-siEZH2-1、LoVo-siEZH2-2细胞株中相较于在RKO-scramble及LoVo-scramble细胞株中表达明显降低,结果具有统计学意义(P0.01)。8.应用Transwell实验检测体外EZH2下调后对RKO与LoVo细胞侵袭能力的影响,结果显示,与RKO-scramble及LoVo-scramble细胞相比,RKO-siEZH2及LoVo-siEZH2的侵袭能力显著降低,统计学分析显示有显著性差异(P0.001)。结论:1.EZH2及H3K27me3在结直肠癌组织中的表达较其配对正常组织中升高,且EZH2及H3K27me3的在癌组织中的表达成正相关。2.在结直肠癌组织中,EZH2及H3K27me3在病理学分期较晚、发生淋巴结转移及远位转移的患者中表达较高,EZH2在具有脉管瘤栓患者中表达也较高。3.EZH2和H3K27me3在结直肠癌组织中高表达预测患者的OS及DFS均较短,有较差预后,但不是独立的预后预测因子。4.成功构建瞬时敲低EZH2的RKO-siEZH2及Lo Vo-siEZH2细胞株,RKO-siEZH2及LoVo-siEZH2细胞株侵袭能力减弱。
【图文】：

结直肠癌,正常组织

17图 1 EZH2 和 H3K27me3 在结直肠癌组织及配对正常组织中的表达Fig.1 Expresion of EZH2 and H3K27me3 in colorectal cancer and itpaired mormal tissues. (A, B, E) EZH2 and (C, D, F) H3K27me3 wermainly nuclear positive and were highly expressed in cancer tissues bulow expressed in normal tissues (200×). Expression level between canceand normal tissures was significantly different (P<0.001)