肿瘤细胞中DIRAS3调控RAC1的分子机制

发布时间：2020-04-03 17:28

【摘要】：据世界卫生组织统计,肿瘤是继心脑血管疾病后导致人类死亡的第二大疾病。其中,90%以上的肿瘤患者死于肿瘤转移。研究肿瘤细胞转移的精细分子机制对于肿瘤的临床治疗具有重要意义。恶性肿瘤细胞从原发部位,经淋巴道、血管或体腔等途径,到达其他部位继续生长,造成组织的局部侵蚀,损伤系统功能,引发剧烈疼痛甚至威胁生命。DIRAS3是小G蛋白Ras亚家族的成员,是该家族中被报道的第一个肿瘤抑制蛋白,在细胞运动过程中起着关键的作用。它能抑制卵巢癌细胞中FAK介导的RHOA信号通路,降低RHOA-GTP水平,减少应力纤维的形成,从而抑制细胞运动。RAC1与RHOA同属小G蛋白Rho亚家族,主要受其激活蛋白GEFs和抑制蛋白GAP、GDI的调控,在RAC1-GTP活化形式和RAC1-GDP失活形式之间转换,调控下游效应蛋白激酶PAK及一些肌动蛋白调控蛋白的活性,影响细胞膜骨架重排和细胞片状伪足的形成,在肿瘤细胞迁移及侵袭过程中起着极其重要的作用。我们的研究发现,DIRAS3能调控非小细胞肺癌细胞中RAC1的表达,对细胞骨架的动态变化有重要的调控作用。因此,本文主要就DIRAS3对RAC1的调控机制进行了研究。首先,我们在Calu-1细胞中转染DIRAS3的质粒,进行细胞划痕实验发现,DIRAS3的过表达抑制Calu-1细胞的运动,同时,F-actin染色结果显示,DIRAS3的高表达抑制了细胞片状伪足的形成,免疫印迹实验发现,DIRAS3的过表达导致调控细胞片状伪足的关键蛋白RAC1表达水平降低,即DIRAS3可能通过调控RAC1的表达影响细胞运动。于是,我们探究了 DIRAS3对RAC1蛋白水平的影响。我们在Calu-1和H1792中转染了 DIRAS3质粒,并用蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂E64D处理,免疫印迹实验发现DIRAS3影响RAC1蛋白酶体途径的降解。随后在293FT细胞中共转染DIRAS3及RAC1的质粒,免疫共沉淀实验结果显示DIRAS3和RAC1存在相互作用,且进一步的实验结果表明,DIRAS3促进RAC1的多聚泛素化。接下来,我们运用siRNA干扰技术,western blot实验技术和蛋白质免疫共沉淀技术找到可能调控RAC1降解的E3连接酶RNF19B。RNF19B又名NKLAM,是RBR E3连接酶家族成员,属于跨膜蛋白。RNF19B在很多方面表现出抑癌基因的功能。研究表明,RNF19B能控制体内肿瘤发展,特别是在抑制肿瘤向远处的侵袭和转移过程中起着重要作用,但是其作用机制尚不明确。我们根据结构域分析对RNF19B进行了分段克隆,免疫共沉淀实验发现RAC1与RNF19B的三个锌指结构域均可结合,但与其RING2结构域结合最为明显。同时,我们在293FT细胞的免疫共沉淀实验发现,RNF19B和DIRAS3能够结合,即DIRAS3可能会促进RNF19B和RAC1的结合。综上所述,我们以非小细胞肺癌细胞为研究模型,研究了 DIRAS3调控RAC1的分子机制,提出DIRAS3可能通过促进E3连接酶RNF19B与RAC1的结合,促进RAC1的泛素化降解,从而抑制细胞运动。
【图文】：

DIRAS3调控细胞运动的分子机制(修改自BadgwellDBetaL,2012)

肿瘤细胞中DIRAS3调控RAC1的分子机制

图４三种Ｅ３连接酶催化泛素化的模式图（修改自Ｆｒａｎｃｅｓｃａ邋Ｅｓｔｅｒ邋Ｍｏｒｒｅａｌｅｅｔａｌ．，２０１６）逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R73-3

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