人乳腺癌中MUC1对PD-L1调节作用的研究

发布时间：2020-04-03 18:11

【摘要】：目的:在肿瘤微环境中,存在某些免疫负性调控分子,特别是PD-L1分子,不仅可以促进肿瘤发生、发展,还参与了肿瘤免疫逃逸。MUC1作为一种跨膜糖蛋白在乳腺癌组织中高表达,参与多种肿瘤的免疫反应。近期的研究已证实,NSCLC(非小细胞性肺癌)中,靶向MUC1后PD-L1分子的表达下调。本课题旨在针对乳腺癌中MUC1对PD-L1分子表达调控的研究,为后续研究PD-L1分子的表达调控奠定一定的实验基础。方法:1、PD-L1及MUC1在乳腺组织的表达情况。从临床收集14例乳腺癌患者的病理组织(乳腺癌组织及癌旁正常组织),将其作为实验标本,并随机分为试验组和对照组。分别使用免疫组化方法染色,标记PD-L1及MUC1分子,根据阳性分子体积占比进行半定量计算,统计PD-L1及MUC1的表达情况以分析MUC1和PD-L1在乳腺癌标本中的相关性。2、筛选PD-L1、MUC1阳性表达人乳腺癌细胞株。通过Western Blot(WB)和流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测人乳腺癌细胞株(MX-1,SKBR3,MDA-MB231、MCF-7、HCC1937)中MUC1、PD-L1蛋白表达情况,筛选出PD-L1和MUC1均表达的细胞株进行后续实验。3、过表达MUC1重组载体及靶向MUC1重组慢病毒载体的构建。PCR扩增出MUC1-mRNA序列同pEX-1载体相连接,构建pEX-1-MUC1的重组质粒;针对MUC1-mRNA序列设计shRNA引物,进一步退火,连接,慢病毒包被,构建靶向MUC1的shRNA-MUC1重组慢病毒。4、体外初步验证MUC1对PD-L1的表达调控。对构建完成后的pEX-1-MUC1重组质粒及shRNA-MUC1重组慢病毒分别转染及侵袭上述筛选出的乳腺癌细胞株,利用q-PCR(Real Time quantitative PCR,RT-qPCR)、WB及流式细胞技术检测MUC1不同处理后,PD-L1的表达情况。5、MUC1对乳腺癌细胞PD-L1调控机制的初步探讨。将PD-L1启动子区目的DNA序列同荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic连接,构建人PD-L1启动子双荧光素酶报告系统,再分别转染处理前后的乳腺癌细胞,利用双荧光素酶活性报告系统原理检测启动子活性强弱;用NF-kB-p65通路抑制剂BAY-8075处理细胞后,比较处理前后细胞启动子活性强弱。结果:1、临床乳腺癌标本的组化显示MUC1和PD-L1的表达存在正相关性;2、成功筛选出PD-L1及MUC1阳性的人乳腺癌细胞株(MD-MBA231,MX-1,SKBR3);3、成功构建了MUC1过表达重组载体(pEX-1-MUC1)及靶向MUC1的慢病毒载体(shRNA-MUC1);4、qPCR和WB结果均显示,乳腺细胞株MB231在过表达MUC1后,相应的PD-L1其mRNA、蛋白水平均较对照组表达量上调;三株乳腺癌细胞株(MB231,MX-1,SKBR3)在靶向MUC1处理后,PD-L1表达量下调;5、双荧光素酶活性验证实验中,乳腺细胞株MB231在过表达MUC1后,相应的PD-L1启动子活性较对照组升高;三株乳腺癌细胞株(MB231,MX-1,SKBR3)在靶向MUC1处理后,PD-L1启动子活性与对照组相比均不同程度降低;三组乳腺癌细胞在BAY作用后其启动子活性均低于未处理组。结论:在人乳腺癌细胞中,MUC1可正向调节PD-L1的表达,并且可能通过NF-k B通路来影响PD-L1启动子活性从而起到对PD-L1的表达调控作用。
【图文】：

数据库分析,人乳,实验结果

Biogps网站分析MUC1及PD-L1在人体组织中基因的表达情况

人乳,免疫组织化学法,乳腺癌组织,单抗

图 1.2 GEPIA 网站分析 MUC1 和 PD-L1 在人乳腺组织中蛋白的表达情况Figure1.2 The expression of MUC1and PD-L1 in human mammary tissue analyzed throughGEPIA1.2.2 免疫组织化学法检测乳腺癌中 MUC1 及 PD-L1 在乳腺癌标本中的表达免疫组织化学法对乳腺癌细胞膜表面进行抗体染色后，通过对抗体着色部分进行面积评定，根据染色面积占比情况区分阳性和阴性。结果显示，经 MUC单抗处理过的乳腺癌组织染色清晰，着色以细胞膜处为主，呈深棕色，阳性细胞数目极多，，分布比较集中；经 PD-L1 单抗处理过的乳腺癌组织着色以细胞膜处为主，呈棕色，分布相对弥散，如图 1.3 所示，实验的统计结果如表 1.2 所示。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9

【参考文献】